三七皂苷R1及Pim-2在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、一、目的:
　　 近年來，國(guó)內(nèi)外大量研究文獻(xiàn)都表明氧化應(yīng)激是許多病理因素造成心血管損傷的共同機(jī)制，在許多心血管疾病的病理過程中都有過量氧自由基產(chǎn)生，同時(shí)抗氧自由基防御機(jī)制卻受到抑制，如動(dòng)脈粥樣硬化(AS)、高血壓病、缺血性心臟病、高脂血癥等。氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸與氧化應(yīng)激的程度相關(guān)，在一定應(yīng)激強(qiáng)度范圍內(nèi)，氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞造成的損傷是可逆的，而超過一定限度，則對(duì)心肌細(xì)胞造成不可逆的損傷，主要包括心肌細(xì)胞的凋亡和壞死。

2、>　　 原癌基因Pim(Proviral integration site of murine)家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的絲/蘇氨酸激酶，屬于鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶，包括Pim-1、Pim-2和Pim-3。大量的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，Pim激酶的上調(diào)與細(xì)胞凋亡的抑制存在顯著的相關(guān)性。Pim-2持續(xù)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞長(zhǎng)期抵抗各種凋亡信號(hào)的刺激。研究證實(shí)Pim-1在Akt通路中保護(hù)心肌細(xì)胞損傷，而在Pim-1缺失小鼠中Pim-2的表達(dá)增高了4.6倍

3、;Pim-1缺失小鼠在心梗后7天，Pim-2的表達(dá)增高2.75倍。但Pim-2在心肌細(xì)胞中的表達(dá)及作用尚缺乏研究，有必要探討Pim-2在心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。
　　 三七是具有多種心血管活性的中藥，臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的防治?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷(Panax notoginseng saponin，PNS)是三七的主要活性成分，含有多種單體皂苷主要有:人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1。本課題以

4、三七皂苷R1為研究對(duì)象，旨在了解三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其參與調(diào)節(jié)的細(xì)胞信號(hào)通路，凋亡相關(guān)蛋白，并了解其對(duì)Pim-2的調(diào)控作用。
　　 二、方法:
　　 1.乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)外科無菌條件下取出乳鼠心臟，用胰酶4℃過夜，終止消化，再用膠原酶消化液逐步消化法分離單個(gè)心肌細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶中，采取差速貼壁分離法以去除心肌成纖維細(xì)胞，得到純度較高的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.H2O2致心肌細(xì)胞

5、氧化應(yīng)激模型建立心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)2-3天后，選取細(xì)胞密度在80％-95％以上的，自律性搏動(dòng)120～140次/min的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，選取不同濃度與時(shí)間點(diǎn)的H2O2干預(yù)心肌細(xì)胞，選擇合適的濃度及干預(yù)時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 3.三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞心肌細(xì)胞培養(yǎng)的第2-3天，細(xì)胞生長(zhǎng)接近80％融合時(shí)，心肌細(xì)胞預(yù)先用不同濃度三七皂苷R1培養(yǎng)24h，進(jìn)行三七皂苷R1毒性測(cè)試，選取合適的高、中、低劑量組進(jìn)行相關(guān)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　

6、　 4.MTT比色法測(cè)定心肌細(xì)胞活力將心肌細(xì)胞接種于九十六孔板，按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素后，按MTT法具體操作步驟進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)其OD值并計(jì)算各組心肌細(xì)胞存活率。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率心肌細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組處理后，用不含EDTA的胰酶消化收集，以Annexin V-FITC/Propidium Iodide進(jìn)行染色，室溫、避光、反應(yīng)5～15min，上流式細(xì)胞儀(激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)

7、530nm)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 6.心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD的檢測(cè)將心肌細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，按不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組處理，處理完畢后，分別按照LDH、MDA、SOD檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀420nm處測(cè)量每組OD值并計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)LDH、MDA、SOD的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上。
　　 7.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達(dá)心肌細(xì)胞按照2×107/孔的濃度接種至六孔板中，取正常培養(yǎng)2-3

8、天后狀態(tài)最佳的心肌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組依次為:正常對(duì)照組、H2O20.5、1、2、3、6h五個(gè)時(shí)間組，50μMH2O2干預(yù)心肌細(xì)胞。用Trizol提取心肌細(xì)胞總RNA，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定OD260/OD280，鑒定提取的RNA純度和濃度。然后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)Gene Bank中Pim-2、GAPDH的基因序列資料，借助于計(jì)算機(jī)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物，上機(jī)進(jìn)行目的基因的熒光定量檢測(cè)。
　　 8

9、.SiRNA沉默心肌細(xì)胞Pim-2基因調(diào)合適的細(xì)胞濃度分別接種于六孔板或九十六孔板中，正常培養(yǎng)2-3天左右，當(dāng)貼璧細(xì)胞達(dá)到80％～90％融合時(shí)，取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。siPORTTM NeoFXTM轉(zhuǎn)染試劑與DMEM培養(yǎng)基混勻室溫孵育15min， siRNA稀釋液等體積混勻，孵育15min。然后將混合液加入培養(yǎng)板混勻。轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48～72h后收集細(xì)胞，再進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。
　　

10、 9.Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞蛋白的表達(dá)心肌細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組處理完成后，以Western及IP細(xì)胞裂解液提取心肌細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。以Actin為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗和二抗，ECL顯色，KODAK Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測(cè)定并分析

11、條帶灰度值以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。
　　 10.統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(x)±s表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用方差分析。若不符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用秩和檢驗(yàn)。方差齊性時(shí)兩兩比較采用LSD法，方差不齊時(shí)兩兩比較采用Tamhane's T2法。多組計(jì)數(shù)資料的比較（各組AV評(píng)分）采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法。

12、各實(shí)驗(yàn)組不同缺血及再灌注時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)α=0.05。
　　 三、結(jié)果:
　　 1.三七皂苷R1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用
　　 1.1 H2O2對(duì)心肌細(xì)胞損傷的濃度效應(yīng)關(guān)系MTT比色法檢測(cè)不同濃度H2O2干預(yù)心肌細(xì)胞3h后，細(xì)胞活力顯著降低，光鏡下可看到細(xì)胞搏動(dòng)減弱甚至停止，細(xì)胞密集區(qū)域出現(xiàn)大片細(xì)胞脫落。與正常對(duì)照組比較，H2O2干預(yù)的各組細(xì)胞活力均有所下降，經(jīng)統(tǒng)

13、計(jì)分析各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=734.372，P＜0.001)，且隨著H2O2濃度的增加各組細(xì)胞活力出現(xiàn)遞減趨勢(shì)。
　　 1.2不同濃度三七皂苷R1對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響不同濃度三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞24h，比較各濃度三七皂苷R1作用后細(xì)胞活力與正常對(duì)照組的差異。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，三七皂苷R1濃度為0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L時(shí)細(xì)胞活力與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.0

14、5），而濃度為50×10-6mol/L、100×10-6mol/L時(shí)，作用心肌細(xì)胞24h后細(xì)胞活力較正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.001)。
　　 1.3三七皂苷R1預(yù)處理對(duì)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞活力的影響三七皂苷R1低、中、高濃度（0.1×10-6mol/L、1×10-6mol/L、10×10-6mol/L）預(yù)處理心肌細(xì)胞24h，然后以H2O2(50μmol/L)作用細(xì)胞3h，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組、模型組，比較各不同濃度三七皂苷R

15、1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力的影響。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，各組間細(xì)胞活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((F=519.758，P＜0.001)。三七皂苷R1預(yù)處理后可呈濃度依賴性減輕H2O2處理后心肌細(xì)胞活力的下降。
　　 1.4三七皂苷R1預(yù)處理對(duì)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率，比較各不同濃度三七皂苷R1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響。經(jīng)三七皂苷R1預(yù)處理后，各組細(xì)胞凋亡與模型組相比有所減少，尤其是高濃

16、度組的凋亡情況顯著改善。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0001)。
　　 1.5三七皂苷R1預(yù)處理對(duì)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD的影響試劑盒檢測(cè)各組心肌細(xì)胞LDH、MDA、SOD值，結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞SOD活性顯著降低，而LDH活性、MDA含量則顯著增加(P＜0.001);三七皂苷R1可呈劑量依賴性增加SOD活性，降低LDH活性、MDA含量，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

17、01)。
　　 2三七皂苷R1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 2.1三七皂苷R1預(yù)處理對(duì)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響
　　 2.1.1 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中P-ERK1/2、總ERK1/2蛋白表達(dá)的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比，模型組(H2O2) P-ERK1/2表達(dá)顯著提高，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比P-

18、ERK1/2表達(dá)顯著降低，其中高劑量組表達(dá)降低最為顯著。各組間P-ERK1/2表達(dá)存在顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.1.2 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中P-JNK、總JNK蛋白表達(dá)的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比，模型組(H2O2) P-JNK表達(dá)顯著提高(P＜0.001)，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。
　　 2.1.3 Western

19、Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中P-P38、總P38蛋白表達(dá)的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)。與正常組相比，模型組(H2O2) P-P38表達(dá)顯著提高(P＜0.001)，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比P-P38表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.2三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)的變化用WesternBlot檢測(cè)各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)

20、，正常組Bax、Bcl-2有一定量的表達(dá)，與正常組相比，模型組Bax表達(dá)顯著增高，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)逐漸降低(P＜0.001);與正常組相比，模型組Bcl-2表達(dá)量降低，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)逐漸增高(P＜0.001)。與正常組相比，模型組Bax/Bcl-2值顯著增高，三七皂苷R1低、中、高劑量組與模型組相比表達(dá)逐漸降低(P＜0.001)。
　　 3 Pim-2在H2O2誘導(dǎo)的心肌

21、細(xì)胞損傷中的表達(dá)及作用
　　 3.1 H2O2顯著上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達(dá)用濃度為50μmol/L的H2O2干預(yù)心肌細(xì)胞0.5、1、2、3、6h，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2 mRNA的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)后的心肌細(xì)胞Pim-2 mRNA的表達(dá)有所增加，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。其中H2O20.5、1h組與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0

22、56);其余各濃度組與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，尤其是H2O23h組Pim-2mRNA的水平增加最顯著;H2O26h組心肌細(xì)胞Pim-2 mRNA表達(dá)水平有所降低，但仍高于正常對(duì)照組。
　　 3.2 H2O2顯著上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2蛋白的表達(dá)應(yīng)用Western blot法檢測(cè)H2O2干預(yù)不同時(shí)間后心肌細(xì)胞內(nèi)Pim-2的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，H2O2干預(yù)后的心肌細(xì)胞Pim-2蛋白表達(dá)增高，其增高的趨勢(shì)與實(shí)時(shí)

23、熒光定量PCR檢測(cè)出的Pim-2mRNA增高趨勢(shì)一致，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 3.3 Pim-2 siRNA干擾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組，H2O2組，siRNA組(H2O2+siRNA)，陰性對(duì)照組(H2O2+NC)。結(jié)果顯示模型組與正常組相比，細(xì)胞凋亡率顯著增加，siRNA干擾組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加(P＜0.001)，陰性對(duì)照組與模型組相比無顯著差異(P＞0.05)，與正常組相比顯著增加(P＜0.

24、001)。
　　 3.4 Pim-2 siRNA干擾對(duì)細(xì)胞LDH、MDA、SOD的影響心肌細(xì)胞經(jīng)Pim-2siRNA干擾后，心肌細(xì)胞SOD活性較模型組顯著降低，而LDH、MDA含量較模型組顯著增高，各指標(biāo)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜.001)，陰性對(duì)照組與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4 Pim-2蛋白表達(dá)調(diào)控
　　 4.1三七皂苷R1上調(diào)Pim-2蛋白的表達(dá)通過Western Blot技術(shù)

25、檢測(cè)各組心肌細(xì)胞Pim-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示模型組(H2O2)與正常組相比Pim-2表達(dá)顯著增高，三七皂苷R1各劑量組Pim-2表達(dá)進(jìn)一步增高，其中三七皂苷R1高劑量組表達(dá)增高最為顯著，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.2 Pim-2 siRNA干擾對(duì)三七皂苷R1預(yù)處理心肌細(xì)胞凋亡率的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組(H2O2)、三七皂苷R1組(H2O2+NG R110μM)、siRNA轉(zhuǎn)染組(H2O2+NG R11

26、0μM+siRNA)、siRNA陰性對(duì)照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果模型組與正常組相比凋亡率顯著增高(P＜0.001)，三七皂苷R1組與模型組相比顯著下降，siRNA組、siRNA陰性對(duì)照組與三七皂苷R1組相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.3 Pim-2 siRNA干擾對(duì)心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)分為正常組，H2O2組，siRNA組(H2O2+siRNA)，陰性對(duì)照組。用WB檢測(cè)各組細(xì)胞中Bax

27、、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化，分析目的條帶的光密度值(IOD)，與正常組相比，(.)模型組Bax表達(dá)顯著增高，siRNA組與模型組相比表達(dá)進(jìn)一步增高(P＜0.01)，陰性對(duì)照組與模型組相比Bax表達(dá)無顯著差異。與正常組相比，模型組Bcl-2表達(dá)量降低，siRNA組與模型組相比表達(dá)進(jìn)一步降低(P＜0.01)，陰性對(duì)照組與模型組相比無顯著差異。模型組與正常組相比，Bax/Bcl-2值顯著增高，siRNA組進(jìn)一步增高(P＜0.01)，陰性對(duì)照組

28、無顯著差異。
　　 四、結(jié)論:
　　 1、H2O2能抑制心肌細(xì)胞活力，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，導(dǎo)致氧化平衡體系的破壞。三七皂苷R1可以抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧活酶活力。
　　 2、H2O2促進(jìn)心肌細(xì)胞ERK、JNK、P38的磷酸化，三七皂苷R1下調(diào)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞中ERK的磷酸化，而對(duì)JNK、P38的磷酸化無顯著調(diào)控。三七皂苷R1下調(diào)H2O2干預(yù)的心肌

29、細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。表明三七皂苷R1抗心肌細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路、凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)。
　　 3、H2O2能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Pim-2激酶的表達(dá)，Pim-2 siRNA干擾可有效沉默Pim-2基因，Pim-2蛋白表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞損傷其保護(hù)作用。
　　 4、三七皂苷R1上調(diào)H2O2干預(yù)的心肌細(xì)胞中Pim-2的表達(dá)，但siRNA干擾Pim-2后，三七皂苷R1仍能抗心肌細(xì)胞凋亡，表明三七皂苷R1抗