氟非尼酮抗炎作用機制研究.pdf

1、第一章氟非尼酮對腎小管上皮細胞炎癥反應(yīng)的影響及作用機制研究
　　研究背景:腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎病的共同通路和主要病理基礎(chǔ)。無論何種病因?qū)е碌穆阅I臟疾病，隨著慢性腎臟疾病的進展往往會導(dǎo)致廣泛的組織纖維化、腎實質(zhì)完全破壞和腎功能衰竭。因此，攻克腎臟纖維化一直是慢性腎衰竭防治中最為關(guān)鍵的科學(xué)問題。抗腎纖維化新藥AKF-PD是本課題組設(shè)計的小分子化合物。目前已證實AKF-PD對腎纖維化實驗動物模型有良好的抗纖維化療效

2、。但AKF-PD治療腎間質(zhì)纖維化的具體機制尚未完全闡明。目前的研究結(jié)果顯示AKF-PD能抑制NADPH氧化酶的表達和減少活性氧的產(chǎn)生，抑制腎小管細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化及成纖維細胞的增殖，下調(diào)致纖維化細胞因子的表達，減少病變腎臟基質(zhì)膠原合成。研究表明炎癥反應(yīng)是腎臟纖維化發(fā)病進程中的早期事件，對腎纖維化的發(fā)病具有重要作用。但AKF-PD對腎臟局部細胞炎癥反應(yīng)的影響及其作用機制尚不清楚。腎纖維化是個復(fù)雜的病理生理過程，需要多種細胞的參與及相互作用，

3、包括腎固有細胞及募集的炎癥細胞。腎臟受到多種致腎損傷因子作用后，一方面非致死受損的腎固有細胞本身發(fā)生活化、增殖，分泌大量炎癥/趨化因子，加重腎損傷;另一方面致死性受損的腎固有細胞發(fā)生壞死、凋亡，細胞死亡后作為抗原激活臨近炎癥細胞，促進炎性細胞分泌炎癥因子/趨化因子，擴大炎癥反應(yīng)，進一步加重腎損傷。
　　腎小管上皮細胞是兼有免疫調(diào)節(jié)作用且生物學(xué)功能十分活躍的細胞。作為腎固有細胞的主要組成部分，其在腎臟疾病局部微環(huán)境形成及調(diào)控中發(fā)揮重

4、要作用。研究報道促炎因子TNF-α在腎間質(zhì)纖維化中表達增加，增加的TNF-α可以加重炎癥反應(yīng)及腎損傷。
　　目的:觀察AKF-PD對促炎因子TNF-α誘導(dǎo)HK-2細胞炎癥因子及趨化因子表達的影響;進一步探討AKF-PD對TNF-α誘導(dǎo)HK-2細胞MAPK及NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:將細胞分為空白對照組，TNF-α刺激組，TNF-α+AKF-PD組，TNF-α+DEX組，分別用2mMAKF-PD、1μMDEX預(yù)

5、處理HK-2細胞1小時后，加入TNF-α（10ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收細胞上清，用ELISA方法觀察AKF-PD對TNF-α刺激的HK-2細胞IL-6、IL-8及MCP-1的影響。
　　將細胞分為空白對照組，TNF-α刺激組，TNF-α+AKF-PD組，TNF-α+MAPKs抑制劑組，分別用2mMAKF-PD預(yù)處理HK-2細胞24小時，10μMMAPKs特異性抑制劑(PD98058、SB203580、SP600125)處理

6、HK-2細胞1小時后，加入10ng/mlTNF-α繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘，提細胞蛋白，用WesternBlot方法檢測AKF-PD對p-ERK1/2，p-p38和p-JNK表達的影響。
　　將細胞分為空白對照組，TNF-α刺激組，TNF-α+AKF-PD組，TNF-α+NF-κB抑制劑組，分別用2mMAKF-PD預(yù)處理HK-2細胞24小時，10μMNF-κB特異性抑制劑BAY11-7082處理HK-2細胞1小時后，加入10ng/mlTN

7、F-α繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，提細胞蛋白，用WesternBlot方法檢測AKF-PD對細胞內(nèi)p-IκBα表達的影響。
　　將細胞分為空白對照組，TNF-α刺激組，TNF-α+AKF-PD組，用2mMAKF-PD預(yù)處理HK-2細胞24小時后，加入10ng/mlTNF-α繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，提取細胞核蛋白，用WesternBlot方法檢測AKF-PD對細胞核內(nèi)P65表達的影響。
　　將細胞分為空白對照組，TNF-α刺激組，TNF-α+

8、AKF-PD組，TNF-α+DEX組，分別用2mMAKF-PD、1μMDEX預(yù)處理HK-2細胞24小時后，加入TNF-α(10ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，采用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測AKF-PD對TNF-α刺激的HK-2細胞NF-κB報告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　結(jié)果:TNF-α刺激HK-2細胞24小時后，細胞上清中IL-6、IL-8及MCP-1的分泌量明顯高于正常組(p＜0.05)，AKF-PD和DEX預(yù)處理HK-2細胞后能

9、夠顯著抑制細胞上清中IL-6、IL-8及MCP-1的含量(p＜0.05)。
　　TNF-α刺激HK-2細胞15分鐘后，p-ERK1/2的表達顯著上升，AKF-PD和p-ERK1/2特異性抑制劑PD98058均明顯抑制ERK1/2的磷酸化(p＜0.05);TNF-α刺激HK-2細胞15分鐘后，p-p38的表達顯著上升，AKF-PD和p-p38特異性抑制劑SB203580均能有效降低p38的磷酸化(p＜0.05);TNF-α刺激HK-

10、2細胞15分鐘后，p-JNK的表達顯著上升，AKF-PD和p-JNK特異性抑制劑SP600125均能顯著減少JNK的磷酸化(p＜0.05)。
　　TNF-α刺激HK-2細胞60分鐘后，細胞內(nèi)p-IκBα的表達顯著上升，特異性抑制劑BAY11-7082明顯抑制IκBα磷酸化(p＜0.05)，而AKF-PD對IκBα磷酸化無明顯影響。
　　TNF-α刺激HK-2細胞60分鐘后，胞核內(nèi)P65的表達顯著上升，AKF-PD明顯抑制核內(nèi)

11、P65的表達，表明AKF-PD阻止P65核移位(p＜0.05)。
　　TNF-α刺激HK-2細胞60分鐘后，NF-κB報告基因的轉(zhuǎn)錄激活顯著上升(p＜0.05)，AKF-PD和DEX預(yù)處理HK-2細胞后能夠顯著抑制NF-κB報告基因的激活(p＜0.05）。
　　結(jié)論:(1)AKF-PD可抑制TNF-α誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞IL-6、IL-8及MCP-1蛋白的表達，AKF-PD在腎小管上皮細胞中發(fā)揮抗炎作用。
　　(2)A

12、KF-PD在腎小管上皮細胞中抗炎作用可能是通過阻斷MAPK信號通路來起作用，其作用機制可能是抑制ERK1/2、P38和JNK的磷酸化。
　　(3)AKF-PD在腎小管上皮細胞中抗炎作用可能是通過阻斷NF-κB信號通路來起作用，其作用機制可能是抑制P65的核移位、NF-κB報告基因的激活。
　　第二章氟非尼酮對小鼠巨噬細胞炎癥反應(yīng)的影響及作用機制研究
　　研究背景:腎臟纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，目前已證實炎癥細胞浸潤在腎臟的慢

13、性炎癥和纖維化過程中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞是一種多功能的炎癥細胞，在腎臟局部炎癥反應(yīng)的免疫防御和免疫功能紊亂中，是一個重要的參與者。有研究發(fā)現(xiàn)，浸潤到局部腎組織巨噬細胞的數(shù)量與纖維化嚴重程度成正相關(guān)，而減少巨噬細胞的數(shù)量可以顯著改善腎臟纖維化。
　　炎癥部位往往同時伴隨廣泛的細胞壞死，在腎纖維化發(fā)生的起始階段，在外界損傷的作用下，致死性受損的腎固有細胞發(fā)生壞死，壞死細胞及其產(chǎn)物會活化臨近的炎性細胞及免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，促進炎癥

14、因子、趨化因子的合成和釋放，進一步加重腎損傷，加速腎纖維化的進程。對于抗腎纖維化新藥AKF-PD如何調(diào)控細胞壞死后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，尤其是對巨噬細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控仍不清楚。
　　目的:觀察AKF-PD對壞死細胞誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞炎癥因子及趨化因子表達的影響;進一步探討AKF-PD對壞死細胞誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞MAPK及NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:用不同濃度（0個/ml、1.5×106個/ml、3.0×106個/ml、6.

15、0×106個/ml、12.0×106個/ml）壞死細胞刺激小鼠巨噬細胞18小時，收細胞上清，用ELISA方法觀察不同濃度壞死細胞對小鼠巨噬細胞TNF-α表達的影響。
　　將細胞分為空白對照組，壞死細胞刺激組，壞死細胞+AKF-PD組，LPS刺激組，用2mMAKF-PD預(yù)處理小鼠巨噬細胞1小時后，加入6.0×106個/ml壞死細胞或單獨加入500ng/mlLPS繼續(xù)培養(yǎng)18小時，收細胞上清用ELISA方法觀察AKF-PD對壞死細胞刺

16、激小鼠巨噬細胞TNF-α及MCP-1的影響。
　　將細胞分為空白對照組，壞死細胞刺激組，壞死細胞+AKF-PD組，用2mMAKF-PD預(yù)處理小鼠巨噬細胞24小時后，加入6.0×106個/ml壞死細胞繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘，提細胞蛋白，用WesternBlot方法檢測AKF-PD對p-ERK1/2、p-p38表達的影響。
　　將細胞分為空白對照組，壞死細胞刺激組，壞死細胞+AKF-PD組，用2mMAKF-PD預(yù)處理小鼠巨噬細胞24小

17、時，加入6.0×106個/ml壞死細胞繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，提細胞蛋白，用WesternBlot方法檢測AKF-PD對細胞內(nèi)IκBα表達的影響。
　　將細胞分為空白對照組，壞死細胞刺激組，壞死細胞+AKF-PD組，用2mMAKF-PD預(yù)處理小鼠巨噬細胞24小時后，加入6.0×106個/ml壞死細胞繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘，提取核蛋白，用WesternBlot方法檢測AKF-PD對細胞核內(nèi)P65表達的影響。
　　結(jié)果:正常對照組小鼠巨噬細

18、胞培養(yǎng)上清中，僅檢測到少量TNF-α的表達，不同濃度壞死細胞刺激小鼠巨噬細胞18小時后，細胞上清中TNF-α的分泌量明顯高于對照組(p＜0.05)，且TNF-α的表達隨著壞死細胞濃度升高先逐漸增加后降低，其中當(dāng)壞死細胞濃度為6×106個/ml時培養(yǎng)上清中TNF-α的表達達高峰。
　　6×106個/ml壞死細胞和500ng/mlLPS單獨刺激小鼠巨噬細胞18小時后，細胞上清中TNF-α及MCP-1的分泌量明顯高于正常對照組(p＜0.

19、05)，AKF-PD預(yù)處理小鼠巨噬細胞后能夠顯著抑制細胞上清中TNF-α及MCP-1的含量(p＜0.05）。
　　6×106個/ml壞死細胞刺激小鼠巨噬細胞15分鐘后，p-ERK1/2及p-p38的表達顯著上升(p＜0.05)，AKF-PD明顯抑制ERK1/2及p38的磷酸化(p＜0.05)。
　　6×106個/ml壞死細胞刺激小鼠巨噬細胞60分鐘后，細胞內(nèi)IκBα的表達顯著下降，表明IκBα被降解(p＜0.05)，而AKF

20、-PD預(yù)處理對IκBα降解無明顯影響。
　　6×106個/ml壞死細胞刺激小鼠巨噬細胞60分鐘后，胞核內(nèi)P65的表達顯著上升，AKF-PD明顯抑制核內(nèi)P65的表達，表明AKF-PD阻止P65核移位(p＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)AKF-PD可抑制壞死細胞誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞TNF-α及MCP-1蛋白的表達，AKF-PD在小鼠巨噬細胞中發(fā)揮抗炎作用。
　　(2)AKF-PD在小鼠巨噬細胞中抗炎作用可能是通過阻斷MAPK