抗肺纖維化新藥吡非尼酮的藥代動力學研究.pdf

1、特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)為間質性肺疾病(interstitiallungdisease)最為嚴重的一種表現(xiàn)形式，是以彌漫性肺泡慢性炎癥和間質纖維化為主要病理特征的疾病。近年來間質性肺纖維化的發(fā)病率呈上升趨勢。目前在世界范圍內將近有500萬人罹患此癥，該類患者平均壽命僅為2.8年，每年約40000患者因之而死亡。此病在我國發(fā)病率也有明顯增加。 吡非尼酮(pirfenidone

2、PF)是一種新型的廣譜抗纖維化藥物，其結構是5-甲基1-苯基2(1氫)吡啶酮(5methyl-1-phenyl-2(1H)-pyridone)。它能抑制膠原的合成，阻止甚至逆轉纖維化發(fā)生和瘢痕形成。本品易于為胃腸道所吸收，在體內各組織中分布廣泛，可通過血腦屏障?；诒酒穼δ[瘤壞死因子-α(TNF-α)的拮抗作用，有可能被用于多發(fā)性硬化癥(MS)和類風濕性關節(jié)炎(RA)的治療。作為特發(fā)性肺纖維化治療藥物，PF已經(jīng)被認定為罕用病治療藥物(o

3、rphandrug)在美國進行各項開發(fā)研究，并根據(jù)美國一項名為“EarlyAccessProgram”項目用于一定數(shù)量的特發(fā)性肺纖維化患者。同時，本品也亦已被日本厚生省指定為“孤兒藥物”。2003年，InterMune公司宣布的一項隨機雙盲多中心Ⅱ期臨床研究結果表明，本品治療特發(fā)性肺纖維化比皮質激素潑尼松更為有效。此項研究共入選53例患者，其中，中至重度特發(fā)性肺纖維化患者有46例，繼發(fā)性肺纖維化患者7例?；颊呙咳湛诜F40mg·kg-

4、1或潑尼松0.33mg·kg-1。接受治療12個月后，以最低氧飽和度為考察指標，結果顯示本品的治療效果優(yōu)于潑尼松；6分鐘步行測試結果表明治療組療效明顯優(yōu)于潑尼松治療組(p=0.014)。通過對其它臨床終點指標的考察，如用力肺活量(FVC)、步行距離等，本品治療組也均優(yōu)于潑尼松組，且具有良好的耐受性。PF的抗纖維化作用已經(jīng)在多種試驗動物纖維化模型中得到證實。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)PF能抑制成纖維細胞的增殖和活性，減少TGF-β的表達。在博萊霉素

5、誘導的鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)它能抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA的表達，抑制巨噬細胞產生PDGF，減少羥脯氨酸的產生，并能改善肺功能。 第一部分吡非尼酮的藥物代謝動力學研究 新藥吡非尼酮(Pirfenidone，PF)的主要藥效學實驗結果顯示，該藥具有良好的抗肺纖維化作用。吡非尼酮的抗肺纖維化作用在國際上亦得到廣泛研究。該藥的研究與開發(fā)對有效防治肺纖維化病變具有重要意義。本項工作采用SD大鼠及beagle犬進行該藥的藥代動力學

6、研究工作，揭示其在二種動物體內的處置規(guī)律，為該藥的進一步臨床應用提供依據(jù)。 第一節(jié)吡非尼酮的藥動學特征 第二節(jié)吡非尼酮在大鼠體內組織分布研究 大鼠按100mg·kg-1劑量灌胃給予PF后，分別于10、60、150min處死。樣品經(jīng)HPLC法檢測組織PF濃度。結果表明，大鼠給藥后PF在各組織中均有分布，其中尤以胃腸道及血流豐富的組織，如脾、肝、心、腎、肺等組織中濃度較高。PF在腦中亦有較高分布，說明該藥能透過血腦屏

7、障。 第三節(jié)吡非尼酮在大鼠體內排泄研究 大鼠灌胃給予PF后，經(jīng)與空白尿樣比較，尿中未發(fā)現(xiàn)PF原形，而主要以代謝物M1、M2形式從尿中排泄；經(jīng)與空白糞便樣比較，糞便中僅發(fā)現(xiàn)痕量PF原形，該藥主要以二種代謝物形式排泄；經(jīng)與空白膽汁比較，膽汁中亦發(fā)現(xiàn)痕量PF原形，亦發(fā)現(xiàn)代謝物M1和少量的M2。 初步的試驗結果表明，PF主要以代謝物的形式從尿中排泄。另有少量代謝物及痕量的原形從糞便及膽汁中排泄。由于無代謝物對照品，尚未作

8、定量檢測。 第四節(jié)吡非尼酮血漿蛋白結合率試驗 本實驗采用平衡透析法研究吡非尼酮血漿蛋白結合率，并進行人和大鼠PF血漿蛋白結合率的比較。用高效液相色譜法測定平衡透析膜兩側的PF藥物濃度，透析膜一側為空白血漿，另外一側為含PF2mg·L-1、20mg·L-1、100mg·L-1藥物濃度的NaH2PO4緩沖液，平衡時間為24小時。在2mg·L-1～100mg·L-1PF濃度范圍內，PF人血漿蛋白結合率分別為77.78％、71.

9、67％、66.19％，PF大鼠血漿蛋白結合率分別為64.09％、84.92％、84.27％。 第二部分吡非尼酮對大鼠肝細胞色素P450酶活性的影響 第一節(jié)吡非尼酮對大鼠P450酶總酶活性的影響 采用差示光譜法測定微粒體混懸液蛋白中細胞色素P450含量。SD大鼠48只，隨機分成空白組、肝藥酶誘導劑組、肝藥酶抑制劑組，吡非尼酮低劑量組、吡非尼酮中劑量組和吡非尼酮高劑量組?？瞻捉M給予1％CMC-Na，誘導劑組地塞米松1

10、00mg·kg-1，抑制劑組酮康唑40mg·kg-1，PF低、中、高劑量組分別為PF25mg·kg-1，50mg·kg-1和100mg·kg-1灌胃給藥，一日一次，連續(xù)6日。取大鼠的肝臟制備肝微粒體，測定肝微粒體中的蛋白濃度，用分光光度計對樣品進行比色。結果表明，該藥在中劑量組(50mg·kg-1)和高劑量組(100mg·kg-1)的P450含量與空白組比較有顯著性差異(P＜0.01)，提示該藥在較大劑量時對肝藥酶有誘導作用。

11、第二節(jié)吡非尼酮對CYP3A及CYP2E1的影響作用 采用Nash-甲醛形成法(Nash比色法)來研究吡非尼酮對大鼠CYP3A及CYP2E的影響，配制0.5ml反應液，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動反應，37℃水浴20min后，加入20％ZnSO40.05ml終止反應，混勻后每管再加入飽和Ba(OH)20.05ml，2500g離心15～20min，將0.35ml上清液轉移至另一試管中，加入0.15mlNash試劑，混勻后加入50℃水浴

12、溫孵30min，冷卻后在412nm測定樣品光密度值。結果表明，在給藥6d和12d后，吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶(反映CYP2E1)的活性影響不顯著(P＞0.05)；而吡非尼酮對大鼠肝微粒體ERD酶(反映CYP3A)具有顯著的誘導作用(P＜0.01)并有明顯的時間依賴性。 第三部分吡非尼酮的代謝產物研究 第一節(jié)吡非尼酮的主要代謝產物及代謝途徑 用LC-MS/MS法首次檢測出大鼠及健康受試者口服PF后，在尿樣及

13、膽汁樣中存在微量原形及10種代謝產物。其中M1為PF的5位甲基羥基化產物，M2為M1的羥甲基進一步氧化為羧酸的產物，M3、M4為二羥基化產物，M5、M6和M7為在二羥基化產物的基礎上，5位羥甲基不穩(wěn)定，進一步氧化為羧酸的產物，M7、M8和M9為代謝物M1、M2與葡萄糖醛酸結合形成的二相代謝產物。上述代謝物文獻中均未見報道。 大鼠口服PF后，在體內迅速代謝，其代謝物分別從膽汁及尿中排除體外，其中尿為主要排泄形式。尿中M2含量最高，

14、為主要的代謝產物，其次為M1。文獻報道吡非尼酮在小鼠體內代謝迅速且完全，尿樣中未發(fā)現(xiàn)母體化合物。本試驗亦證明PF在大鼠體內代謝迅速，但尿中仍檢測到痕量原形化合物，說明吡非尼酮雖代謝迅速但不完全。 大鼠口服PF后，其原形及代謝物均廣泛分布于各組織中。通過對其靶器官肺組織的LC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)準分子離子為m/z202和216的化合物，其質譜圖與尿中M1和M2相同，故可推定為PF的醇化產物和羧酸化產物。 健康受試者口服PF后，

15、其原形及代謝物亦主要隨尿排泄。尿中代謝物M2含量最高，為主要的代謝產物。在人尿中代謝物M1相對含量低于大鼠，而二相代謝產物的相對含量要高于大鼠。人尿中未檢測到準分子離子為m/z232的三個代謝物M5、M6、M7。 根據(jù)檢測結果可以推斷，吡非尼酮在大鼠及健康受試者體內的主要代謝途徑為：吡非尼酮吡啶環(huán)上的5位甲基先氧化為醇成為PF羥基化產物M1，M1的羥甲基進而氧化為羧酸M2。M1、M2再與葡萄糖醛酸結合后產生二相代謝產物M7、M8

16、和M9而排出體外。其次還產生少量的二羥基化產物M3，M4。 第二節(jié)吡非尼酮的主要代謝產物M2的結構確定 20只大鼠灌胃口服PF100mg·kg-1后1h，心室采血，收集血漿，樣品經(jīng)提取后用半制備色譜柱分離，收集M2流份，經(jīng)減壓干燥、醋酸乙酯萃取、適量去離子水洗三次后，減壓除去溶劑，用于純度鑒定及結構鑒定。分離提純后的吡非尼酮主要代謝產物M2經(jīng)HPLC純度鑒定為97.2％。經(jīng)UV、IR、MS和NMR綜合解析，M2的結構確證