吡非尼酮抑制人Tenons囊成纖維細(xì)胞增殖的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：青光眼是全球第二位不可逆性致盲眼病，以病理性高眼壓、進(jìn)行性視神經(jīng)變性和視野缺損為特征。疾病的發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重危害人類健康，帶來沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此青光眼的防治是臨床工作和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重點(diǎn)，有重大的衛(wèi)生學(xué)和社會(huì)學(xué)意義。 濾過性手術(shù)是青光眼手術(shù)治療的主要手段之一，術(shù)后濾過區(qū)瘢痕化是手術(shù)失敗的最主要原因。抗代謝藥物如絲裂霉素（MMC）和5-氟尿嘧啶（5-FU）等的應(yīng)用大大提高了抗青光眼濾過性手術(shù)的成功率，但使用不當(dāng)常導(dǎo)致嚴(yán)重

2、的并發(fā)癥，如愈合延遲、淺前房、濾過泡滲漏、低眼壓性眼病、眼內(nèi)炎等。這些并發(fā)癥嚴(yán)重影響手術(shù)效果，加重了視功能的損害。遺憾的是，抗青光眼術(shù)后濾過區(qū)瘢痕形成的病因復(fù)雜，治療手段不盡人意，是當(dāng)前青光眼研究的難題。面對(duì)這一項(xiàng)挑戰(zhàn)，我們迫切需要尋找新型安全有效的抗青光眼術(shù)后濾過區(qū)瘢痕化的藥物，同時(shí)制定相應(yīng)的治療策略和思維，為解決這一難題帶來契機(jī)。 吡非尼酮是一種新型的廣譜抗纖維化藥物，其高效的抗纖維化效應(yīng)以及安全性已經(jīng)在動(dòng)物研究以及臨床試驗(yàn)

3、中得到驗(yàn)證。這些實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，該藥物的作用機(jī)制包括抑制轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）以及腫瘤壞死因子α（TNF—α）等細(xì)胞因子的生成，而這些因子恰恰是抗青光眼術(shù)后濾過區(qū)瘢痕化發(fā)生發(fā)展過程中重要的細(xì)胞信號(hào)通路機(jī)制。 基于這些考慮，本研究通過觀察吡非尼酮對(duì)體外培養(yǎng)人Tenons囊成纖維細(xì)胞（HTFs）增殖的效應(yīng)，同時(shí)探討其可能的細(xì)胞信號(hào)通路機(jī)制，為下一步吡非尼酮應(yīng)用抗青光眼術(shù)后濾過區(qū)瘢痕化的實(shí)驗(yàn)研究提供

4、重要的理論依據(jù)。 方法： 1、HTFs的體外培養(yǎng)和鑒定：取正常供體新鮮的Tenons囊組織，采用組織塊培養(yǎng)法，進(jìn)行成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并利用光鏡、HE染色、免疫組化法觀察鑒定； 2、MTT法檢測不同濃度（0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1mg/ml）吡非尼酮作用不同時(shí)間（0、12、24、48、72h）后，HTFs的A值變化，初步確定吡非尼酮的起始作用濃度和最適作用濃度以及最適作用時(shí)間； 3

5、、應(yīng)用MTT法和流式細(xì)胞儀進(jìn)一步確定吡非尼酮的起始作用濃度和最適作用濃度； 4、采用劃痕法檢測HTFs的遷移能力； 5、通過臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定吡非尼酮對(duì)HTFs增殖的抑制作用是否由藥物的細(xì)胞毒性引起； 6、通過激光共聚焦顯微鏡對(duì)吡非尼酮作用后TGF—β1、TGF—β2、TGF—β3蛋白表達(dá)進(jìn)行定位觀察；Western—blot法檢測吡非尼酮作用后TGF—β1、TGF—β2、TGF—β3蛋自表達(dá)的變化；應(yīng)用RT—PC

6、R法檢測吡非尼酮作用后TGF—β1、TGF—β2、TGF—β3及Smad3、Ⅰ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）基因表達(dá)的變化，探討吡非尼酮抑制HTFs增殖的可能機(jī)制。 結(jié)果: 1、體外成功培養(yǎng)正常HTFs，細(xì)胞長梭形，胞漿豐富，胞核大，生長能力強(qiáng)，呈漩渦狀或羽毛狀生長；HTFs波形蛋白染色陽性、角蛋白染色陰性，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，而非上皮細(xì)胞； 2、不同濃度（0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.

7、5、1mg/ml）吡非尼酮作用于HTFs不同時(shí)間（0、12、24、48、72h）后，空白對(duì)照組細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞生長能力強(qiáng)，當(dāng)吡非尼酮濃度達(dá)到0.3mg/ml以上、時(shí)間達(dá)到24h后，吡非尼酮作用組細(xì)胞生長受到抑制，形態(tài)細(xì)長、密度低、不規(guī)則形生長，從形態(tài)學(xué)上證實(shí)吡非尼酮抑制HTFs增殖；應(yīng)用MTT法檢測不同濃度（0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1mg/ml）吡非尼酮作用于HTFs不同時(shí)間（0、12、24、48、72h）后HT

8、Fs的A值，初步證實(shí)0.2mg/ml和0.3mg/ml可能為吡非尼酮抑制HTFs增殖的起始作用濃度和最適作用濃度，24h為最適作用時(shí)間；我們?cè)俅瓮ㄟ^MTT法檢測0、0.15、0.2、0.25、0.3mg/ml吡非尼酮作用于HTFs（24h）后細(xì)胞的A值，最終證實(shí)吡非尼酮抑制HTFs增殖的起始作用濃度和最適作用濃度分別為0.15mg/ml和0.3mg/ml； 3、利用流式細(xì)胞儀檢測0、0.15、0.2、0.25、0.3mg/ml吡

9、非尼酮作用24h后HTFs的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示0.15mg/ml吡非尼酮能將HTFs阻滯在G1期，這種阻滯作用呈濃度依賴性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)吡非尼酮抑制HTFs增殖的起始作用濃度和最適作用濃度分別為0.15mg/ml和0.3mg/ml； 4、劃痕法檢測不同濃度（0、0.15、0.3mg/ml）吡非尼酮作用24h后對(duì)HTFs遷移能力的影響，結(jié)果顯示吡非尼酮作用后HTFs的遷移能力受到抑制； 5、臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測

10、不同濃度（0、0.15、0.3、1mg/ml）吡非尼酮作用24h后HTFs的活細(xì)胞率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡非尼酮作用組活細(xì)胞率和對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)藥物濃度達(dá)到1mg/ml時(shí)仍未觀察到藥物的毒性作用； 6、激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TGF—β1、TGF—β2、TGF—β3蛋白主要在HTFs的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，吡非尼酮對(duì)這三種蛋白的表達(dá)均有抑制作用；Western—blot檢測結(jié)果顯示：吡非尼酮作用后，TGF—β1、2、3蛋白表達(dá)均受到抑

11、制；RT—PCR檢測吡非尼酮作用后，TGF—β1、2、β3及其下游因子Smad3、Ⅰ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2）基因表達(dá)均減少。 結(jié)論： 1、吡非尼酮對(duì)體外培養(yǎng)HTFs的增殖有明顯抑制作用，這種抑制作用呈濃度依賴關(guān)系；0.15mg/ml和0.3mg/ml分別為吡非尼酮抑制HTFs增殖的起始作用濃度和最適作用濃度，24h為最適作用時(shí)間； 2、吡非尼酮具有將HTFs阻滯在G1期作用，這種阻滯作用呈濃度依賴性；