血清抗端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)自身抗體作為腫瘤標(biāo)志物的初步研究.pdf

1、目的：通過(guò)構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶N-端（hTERT-n）蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，并分離提純獲得高純度的hTERT-n蛋白，以該蛋白為抗原利用間接ELISA技術(shù)檢測(cè)癌癥患者、良性疾病患者和正常熱血清中抗hTERT自身抗體水平，為血清抗hTERT自身抗體能否作為一種新的腫瘤標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.重組質(zhì)粒pMAL-p5X-hTERT-n和質(zhì)粒載體pMAL-c5X經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NdeⅠ雙酶切，電泳分離后，切膠回收質(zhì)粒載體

2、和目的基因，用T4 DNA連接酶連接；2.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株NEB10-β感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證；3.重組質(zhì)粒pMAL-c5X-hTERT-n轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株TB1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，12％SDS-PAGE初步驗(yàn)證目的蛋白表達(dá)情況；4.重組表達(dá)菌TB1擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，用直鏈淀粉樹脂層析柱和BioLogic DuoFlow蛋白純化儀提純目的蛋白，經(jīng)SD

3、S-PAGE、Western blo、考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法鑒定蛋白大小和測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。5.間接ELISA法檢測(cè)239例肺癌、215例乳腺癌、123例直腸癌、122例結(jié)腸癌、105例肺炎患者和120例正常人血清抗hTERT-n自身抗體的水平，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建 pMAL-c5X-hTERT-n-TB1原核表達(dá)菌②成功獲得高純度重組hTERT-n蛋白，濃度為1.0 mg/mL；③間接ELISA法檢測(cè)血清抗h

4、TERT-n自身抗體結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組、肺炎組和肺癌組血清抗hTERT-n自身抗體測(cè)定濃度（X±SE）分別為4.67±0.19、5.86±0.28和6.95±0.20；肺癌組和肺炎組高于健康對(duì)照組（P<0.05），肺癌組與肺炎組差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺癌、直腸癌、結(jié)腸癌組血清抗hTERT-n自身抗體測(cè)定濃度（X±SE）分別為6.53±0.21、7.47±0.31和6.76±0.27；后三組與正常組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<