喜樹堿類衍生物CPT21對人胃癌抑制作用的研究.pdf

1、喜樹堿(CPT)是從我國特有植物喜樹中提取出來的一種五環(huán)生物堿，是一類新型的抗腫瘤藥物。Topo I在DNA的復制轉錄和重組中均起重要作用。喜樹堿類化合物因抑制Topo I而形成喜樹堿類化合物-Topo I-單鏈DNA復合體，使腫瘤細胞內功能正常的Topo I轉變?yōu)閷е翫NA鏈斷裂的致傷物。此外，還發(fā)現(xiàn)喜樹堿類化合物具有誘導細胞凋亡的作用。但臨床研究表明，喜樹堿會產(chǎn)生骨髓抑制、嘔吐、腹瀉和血尿等嚴重的副作用。且其水溶性較差，難以制成合適

2、的劑型，也限制了它的臨床應用。由于喜樹堿類化合物在化學結構上都含有一個末端的內酯環(huán)，使得它們在水溶液中呈迅速地、pH依賴性地、非酶作用地水解，形成開環(huán)的氫氧和羧酸基團。這個水解過程使得這些喜樹堿類化合物對Topo I 的作用大大減弱。據(jù)此我們合成了7-(3’-哌啶基丙炔基)喜樹堿(CPT21)，它是一種通過Sonogashira反應合成的喜樹堿7位取代衍生物，且具有較好的水溶性。本文對CPT21的體內外抗腫瘤活性進行了系統(tǒng)的評價，并對其

3、抑制胃癌生長的作用抑制進行了深入的研究。 目的：研究CPT21的體內體外抗腫瘤活性，并對其抗腫瘤作用機制進行研究。 方法：首先用MTT法測定CPT21對10株不同來源的腫瘤細胞株的體外抑制作用，并分別計算1050值，以比較體外抑制作用強度；同時采用拓撲異構酶I催化活性檢測模型，通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測CPT21對拓撲異構酶I活性的體外抑制作用；通過荷SGC-7901移植瘤裸鼠模型評價CPT21的體內抗腫瘤活性：為了深入研

4、究CPT21在體內外抑制腫瘤生長的機制，我們選取了胃癌SGC一7901細胞并使用流式細胞術測定CPT21誘導SGC一7901細胞的凋亡率；為進一步研究CPT21引起細胞凋亡的機制，我們采用JC-1染色法觀察經(jīng)CPT21處理過的SGC-7901細胞中線粒體膜電位(Δψm)的變化，用Westernblot法檢測凋亡相關蛋白表達，用caspase活性檢測試劑盒測定caspase．3活性的變化；最后，我們還用雞胚尿囊膜實驗模型評價CPT21對新

5、生血管形成的影響。 結果： 1. CPT21對不同來源的10株腫瘤細胞株都具有顯著的體外抑制作用。M1r結果顯示，CPT21對人肝癌BeI-7402細胞，人慢性髓性白血病K562細胞，人急性早幼粒白血病HL-60細胞，人雄性激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞，人口腔表皮癌KB細胞，人食道癌ECA-109細胞，人非小細胞肺癌A549細胞，人乳腺癌MCF-7細胞，人腦膠質瘤U251細胞和人胃癌SGC-7901細胞的IC50值分

6、別為3.0±1.7 μM，0.13±0.04 μM，0.10±0.05 μM，0.10士0.08μM，5.0±2.1μM，7.9±3.5μM，7.3±3.5 μM，1.3±1.1 μM，12.0±4.1 μM，6.3±3.1 μM。 2.CPT21對拓撲異構酶I活性具有顯著的體外抑制作用，呈一定的量效關系。在200 μM劑量下與陽性藥物SN38比較，作用強于SN38。 3.裸鼠移植瘤模型的實驗結果顯示，隔2或3天連續(xù)給藥

7、26天后，CPT2110.0 mg/kg劑量組的抑瘤率達到了75.1％，治療效果好于相同劑量的陽性藥物Irinotecan，65.1％CPT21 5.0 mg/kg劑量組的抑瘤率也達到了42.5％。 4.流式細胞術結果表明，CPT21能誘導SGC-7901細胞呈時間和劑量依賴性的凋亡。結果顯示，經(jīng)5.0 μM CPT21處理12， 24和48小時后，SGC-7901細胞的凋亡率分別為10.2％，13.5％和69.7％。用不同濃度

8、的CPT21(2.5，5.0和10.0 μM)處理SGC-7901細胞24小時后，其凋亡率分別為6.2％，13.5％和34.5％。 5.CPT21可誘導SGC．7901細胞的線粒體膜電位下降。5.0 μM CPT21處理SGC-7901細胞不同時間(12， 24和48小時)后，綠色/紅色熒光比值從2.9上升到12.3。而用不同濃度CPT21(2.5，5.0和10.0 μM)處理SGC-7901細胞24小時后，綠色，紅色熒光比值從

9、.9上升到45.0。證實CPT21能引起線粒體膜電位呈時間和劑量依賴性地下降。 6.Western blot結果顯示，CPT21促使SGC-7901細胞內PARP降解，procaspase-9和XIAP表達的下調，磷酸化c-Jun NH2-terminal protein kinase(JNK)表達的增加，同時誘導caspase-3活性的增加。CPT21還促使Bax蛋白表達上調和Bcl-2蛋白表達下調，使Bax/Bcl-2比值明

10、顯增加。此外，CPT21可誘導SGC-7901細胞內p53蛋白和p21蛋白的表達增加。 7.雞胚尿囊膜實驗結果顯示，5.0 pg/蛋和1.0 pg/蛋CPT21明顯抑制了新生血管的形成，其中5.0 μg/蛋CPT21的抑制作用與5.0 μg/蛋陽性對照藥物拓撲替康的抑制作用相似。 結論：CPT21具有廣譜的抗腫瘤活性，同時顯示出了較強的體內外抑制腫瘤生長的作用。它可顯著抑制SGC-7901細胞增殖并誘導其發(fā)生凋亡，其機制