氧化苦參堿治療慢性胰腺炎量效關(guān)系的研究及其對(duì)胰腺組織TGF-β-,1-RI的影響.pdf

1、1大鼠慢性胰腺炎模型的建立 1.1目的：腹腔內(nèi)注射不同劑量的DDC，觀察大鼠血清淀粉酶的變化、并發(fā)癥、死亡率及胰腺病理改變，探索最佳的造模劑量。 1.2方法：雄性Wistar大鼠80只，按照隨機(jī)數(shù)字表分為陰性對(duì)照組(NC組，n=16)和DDC500mg/kg組(CPⅠ組，n=16)，DDC 700mg/kg組(CPⅡ組，n=16)，DDC900mg/kg組(CPⅢ組，n=16)，DDC400mg/kg 10％遞增組(CP

2、Ⅳ組，n=16)。隔日腹腔內(nèi)注射相應(yīng)劑量的DDC，NC組則隔日腹腔內(nèi)注射生理鹽水，以上各組分別在6d、12d、24d、32d處死大鼠(n=4)，取血標(biāo)本及組織標(biāo)本，檢測(cè)血清淀粉酶的變化，用HE染色、Masson染色觀察膠原纖維面積百分比的變化，觀察大鼠并發(fā)癥及死亡發(fā)生率。 1.3結(jié)論：用700mg/kg，隔日腹腔內(nèi)注射DDC，持續(xù)15次可以制成大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化的模型，腺泡間及小葉周圍有膠原纖維增生，及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡壞

3、死不明顯，導(dǎo)管及胰島無(wú)明顯病理學(xué)改變。血清淀粉酶在一周左右高于正常，隨后逐漸降至正常。在模型形成過(guò)程中，可以出現(xiàn)眼眶出血及鼻出血、震顫、尿失禁等并發(fā)癥。 2.OM治療CP的量效關(guān)系 2.1目的：用不同劑量的OM對(duì)CP大鼠進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)其對(duì)血清纖維化指標(biāo)、膠原纖維增生面積及α-SMA表達(dá)的影響，從而觀察其對(duì)胰腺纖維化的治療效果及量效關(guān)系。 2.2方法：健康雄性Wistar大鼠，28只。隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(NC組，n

4、=4)、模型組(CP組，n=4)、CP+OM 25mg/kg(OMⅠ組，n=4)、CP+OM 50mg/kg(OMⅡ組，n=4)、CP+OM100mg/kg(OMⅢ，n=4)、CP+OM200mg/kg(OMⅣ組，n=4)、CP+OM 400mg/kg(OMV組，n=4)7組。NC組腹腔注射生理鹽水2ml，隔日一次，連續(xù)15次，模型組以700mg/kg的劑量腹腔注射DDC，隔日一次，連續(xù)15次，OM干預(yù)組在隔日腹腔注射DDC的同時(shí)分別采

5、用25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg五個(gè)劑量每日腹腔注射OM，一個(gè)月后處死動(dòng)物。用ELISA法檢測(cè)血清中HA、LN、PCⅢ的濃度。在顯微鏡下觀察標(biāo)本四角及中央5個(gè)視野中的面積百分比，測(cè)定每一視野中膠原含量，以纖維占視野面積的百分比表示膠原含量，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Western blot方法檢測(cè)不同劑量OM治療組胰腺組織α-SMA的表達(dá)情況，采用IMAGE PRO PLUS圖像分析軟

6、件分析α-SMA條帶與β-actin累積光密度值的比值。 2.3結(jié)果： 2.3.1血清學(xué)纖維化指標(biāo)的檢測(cè)： HA在血清中的含量，NC(98.77±27.81)μg/L、CP(278.25±45.77)μg/L、OMⅠ(295.67±61.61)μg/L、OMⅡ(181.67±27.54)μg/L、OMⅢ(170.12±31.12)μg/L、OMⅣ(201.01±18.33)μg/L、OMⅤ(185.01±29.2

7、1)μg/L。NC組顯著低于其余各組(P<0.05)；CP組與OMⅠ比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而較其余OM干預(yù)組高(P<0.05)。OMⅡ、OMⅢ、OMⅣ、OMⅤ各組間比較無(wú)顯著差異(p>0.05)。 LN在血清中的含量，NC(46.73±9.92)μg/L、CP(163.59±29.23)μg/L、OMⅠ(157.04±31.43)μg/L、OMⅡ(95.27±38.66)μg/L、OMⅢ(78.17±30.77)μg

8、/L、OMⅣ(94.77±25.31)μg/L、OMⅤ(95.11±19.24)μg/L。NC組較CP組、OMⅠ低(P<0.05)，與其余各組無(wú)顯著差異(P>0.05)。CP組與OMⅠ比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但高于其余各組(P<0.05)。OMⅡ、OMⅢ、OMⅣ、OMⅤ各組間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 PCⅢ在血清中的含量，NC(12.91±3.51)μg/L、CP(51.13±5.88)μg/L、OMⅠ(41.01±1

9、4.12)μg/L、OMⅡ(34.67±9.07)μg/L、OMⅢ(32.93±4.30)μg/L、OMⅣ(33.33±7.07)μg/L、OMV(34.10±8.89)μg/L。其它組均高于NC組(P<0.05)；CP組與OMⅠ比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而高于OMⅡ、OMⅢ、OMⅣ、OMⅤ(P<0.05)。OMⅡ、OMⅢ、OMⅣ、OMⅤ各組間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 2.3.2胰腺組織病理學(xué)改變Masson染色

10、中，膠原纖維面積百分比NC(2.65±0.393)、CP(40.34±7.17)、OMⅠ(36.73±2.84)、OMⅡ(27.88±3.48)、OMⅢ(13.35±4.06)、OMⅣ(21.97±6.85)、OMⅤ(21.56±3.67)。NC組膠原纖維面積百分比低于其余各組(P<0.05)；CP組與OMⅠ比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而高于OMⅡ、OMⅢ、OMⅣ、OMⅤ(P<0.05)。在此四個(gè)劑量中，OMⅢ膠原纖維面積百分比低

11、于其余三組OM干預(yù)組(P<0.05)。OMⅡ、OMⅣ、OMⅤ之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2.3.3不同劑量OM對(duì)胰腺組織中α-SMA的影響α-SMA與β-actin的相對(duì)表達(dá)量NC(0.78±0.06)、CP(1.16±0.03)、OMⅠ(1.12±0.03)、OMⅡ(0.99±0.05)、OMⅢ(0.97±0.02)、OMⅣ(1.05±0.02)、OMⅤ(1.06±0.03)。在NC組α-SMA相對(duì)表達(dá)量低于其余各組(

12、P<0.05)；CP組與OMⅠ比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而高于其余各組(P<0.05)；OMⅡ與OMⅢ、OMⅣ比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但低于OMⅤ(P<0.05)；OMⅢ低于OMⅣ、OMⅤ(P<0.05)；OMⅣ與OMⅤ比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2.4結(jié)論： OM可以降低血清中HA、LN、PCⅢ；OM可以通過(guò)減少胰腺組織內(nèi)膠原的生成及α-SMA的表達(dá)抑制胰腺纖維化的發(fā)展，OM治療CP的最佳劑量為100

13、mg/kg。 3.OM對(duì)CP大鼠胰腺組織TGF-β1RⅠ的影響 3.1目的：觀察OM干預(yù)CP大鼠后胰腺組織TGF-β1RⅠ的表達(dá)變化，從而初步探索OM對(duì)CP的治療機(jī)制。 3.2方法：雄性Wistar大鼠40只，按照隨機(jī)數(shù)字表分為陰性對(duì)照組(NC組，n=10)：以300mg/kg隔日腹腔內(nèi)注射生理鹽水；模型組(CP組，n=10)以700mg/kg隔日腹腔內(nèi)注射DDC；OM治療組(OT組，n=10)以700mg/kg

14、隔日腹腔內(nèi)注射DDC，一周后開始每日腹腔注射OM 100mg/kg。OM預(yù)防組(OP組，n=10)依照模型組方法注射DDC的同時(shí)每日腹腔內(nèi)注射OM 100mg/kg。到30天時(shí)停止注射DDC，但仍繼續(xù)注射OM。將上述四組分別依20d、40d處死大鼠(n=5)，取組織標(biāo)本用Masson染色法觀察膠原纖維面積百分比，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)TGF-β1RⅠ的變化，采用IMAGEPRO PLUS圖像分析軟件分析膠原纖維量的變化及T

15、GF-β1RI條帶與β-actin的累積光密度值(IOD)的比值。 3.3結(jié)果： 3.3.1胰腺組織的病理結(jié)果Masson染色可見膠原纖維面積百分比在20d時(shí)CP組(22.54±4.45)、OP組(13.16±1.84)、OT組(19.58±2.78)較NC組(2.45±0.24)高(P<0.05)，OP組與OT組較CP組降低(P<0.05)；在40天時(shí)CP組(35.14±3.27)較OP組(25.14±3.67)、OT

16、組(28.68±2.55)、NC組(3.0±0.32)高(P<0.05)，NC組低于其余各組(P<0.05)，CP組與OT組在40天時(shí)的膠原纖維面積百分比較20天時(shí)增高(P<0.05)。 3.3.2胰腺組織中TGF-β1RI的相對(duì)含量的變化在20d與40d，CP(0.81±0.04/1.06±0.02)、OT(0.60±0.06/0.78±0.09)、OP(0.73±0.05/0.76±0.06)各組的TGF-β1RI相對(duì)表達(dá)量