HSP90抑制劑17-DMAG在肺動脈高壓中的作用與機制研究.pdf

1、肺動脈高壓（Pulmonary artery hypertension,PAH）是一類以肺小動脈收縮、肺血管增殖與重構(gòu)為主要特征，由此引起肺血管阻力進行性升高，最終導(dǎo)致右心功能衰竭的肺血管疾病。肺動脈高壓屬于肺高壓的第1類，其右心導(dǎo)管檢查符合，靜息狀態(tài)下平均肺動脈壓升高（≥25mmHg），且肺毛細血管楔壓正常（≤15mmHg）。
　　肺動脈高壓患者發(fā)病年齡輕、病情進展快、生活質(zhì)量差、死亡率高，未經(jīng)特異性靶向治療的特發(fā)性肺動脈高壓患

2、者每年將以15％的速率死亡，中位生存時間僅為2.8年，故被稱為“惡性心血管病”。在過去二十余年，前列環(huán)素類藥物等特異性的靶向治療藥物、基因干細胞治療、去肺交感神經(jīng)方法等新技術(shù)、新療法的應(yīng)用給肺動脈高壓患者帶來了新的希望，但迄今為止仍缺乏確切有效的根治方法。
　　熱休克蛋白（Heat shock protein,HSP）是上個世紀被發(fā)現(xiàn)，并確認了其生物學功能。HSP90是其中的一種亞型，在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP90產(chǎn)物急劇增加，輔助蛋白

3、質(zhì)重折疊，這有助于損傷的細胞恢復(fù)正常功能，提高機體生存能力。HSP90的結(jié)合底物主要是信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的蛋白激酶和一些突變蛋白質(zhì)，如Raf蛋白激酶、蛋白激酶B、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子等，這些信號傳導(dǎo)分子的激活和過表達對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用。HSP90抑制劑可以拮抗HSP90與效應(yīng)蛋白的結(jié)合，從而阻斷多種信號傳導(dǎo)途徑，因此，被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療。從病理過程來看，肺動脈高壓的肺血管細胞增殖與腫瘤細胞類似，均表現(xiàn)為細胞的增殖過度和凋亡抑

4、制。那么，HSP90及其效應(yīng)蛋白是否參與了肺動脈高壓的血管增殖和重構(gòu)過程？在肺動脈高壓的肺血管增殖調(diào)控過程中，HSP90是起促進作用還是抑制作用？HSP90抑制劑能否用于肺動脈高壓的治療？迄今為止，國內(nèi)外鮮有關(guān)于HSP90與肺動脈高壓關(guān)系的研究，亦無HSP90抑制劑用于肺動脈高壓的報導(dǎo)。
　　鑒于以上設(shè)想，本課題將評價HSP90在肺動脈高壓患者中的表達和作用。建立野百合堿藥物誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型，檢測肺動脈高壓大鼠外周血HSP

5、90的含量及肺組織HSP90的mRNA和蛋白的表達。采用HSP90抑制劑17-二甲氨基-17-去氧甲基格爾德霉素（17-DMAG）干預(yù)肺動脈高壓大鼠，評價17-DMAG在肺動脈高壓治療中的安全性和有效性。在細胞學上，通過評價HSP90抑制劑對平滑肌細胞的作用，探討HSP90抑制劑治療肺動脈高壓的可能作用機制，為肺動脈高壓的發(fā)病機制研究提供實驗依據(jù)以及新的治療思路。
　　本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分 肺動脈高

6、壓患者HSP90的表達
　　目的：評價HSP90在肺動脈高壓患者外周血的含量，及與肺動脈高壓病情的關(guān)系。
　　方法：1、統(tǒng)計入選患者的一般情況。2、入選患者擇期行右心導(dǎo)管檢查，根據(jù)肺動脈壓力，將患者分為肺動脈高壓組和正常對照組，剔除臨界肺動脈高壓患者。3、用ELISA檢測患者外周血HSP90含量。
　　結(jié)果：1、兩組人群在年齡、身高、體重、收縮壓、舒張壓、心率和左室射血分數(shù)等參數(shù)均無明顯差異（P>0.05），肺動脈高壓

7、患者中女性比例明顯升高，男女比為1:2。2、肺動脈高壓患者的肺動脈收縮壓、舒張壓和平均肺動脈壓均明顯高于對照組（P<0.01）。3、與對照組相比，肺動脈高壓患者外周血的HSP90含量明顯高于對照組（10.12±7.20ng/mLvs6.11±2.84ng/mL,P<0.05）。
　　結(jié)論：肺動脈高壓患者外周血HSP90含量升高，且與肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。
　　第二部分 肺動脈高壓大鼠模型HSP90的表達
　

8、　目的：建立肺動脈高壓大鼠動物模型，評價HSP90在肺動脈高壓大鼠的表達及作用。
　　方法：1、SD雄性大鼠頸背部皮下注射野百合堿50mg/kg。2、建模3周后大鼠行右心導(dǎo)管檢查，測量右室壓和肺動脈壓。3、大鼠從眼眶或頸動脈取外周血，檢測肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白細胞、中性粒細胞、高敏C反應(yīng)蛋白和血沉等。4、觀察大鼠心、肺、肝、腎組織，并作HE染色病理切片，觀察其病變情況，比較肺小動脈中膜厚度百分比、中膜面積百分比及右心室肥厚指數(shù)RV/

9、(LV+IVS)。
　　結(jié)果：1、模型組大鼠右室收縮壓和平均肺動脈壓均明顯高于正常對照組大鼠（P<0.01），且模型組大鼠平均肺動脈壓均大于25mmHg，提示了野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠建模成功。2、兩組大鼠在外周血肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白細胞和中性粒細胞均無明顯差異（P>0.05），但肺動脈高壓大鼠的血沉與高敏C反應(yīng)蛋白明顯高于對照組（P<0.01）。3、病理切片HE染色顯示肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌增生、管腔狹窄，心肌肥厚、纖維

10、化，肝臟、腎臟明顯淤血。模型組大鼠肺小動脈中膜厚度百分比、中膜面積百分比及右心室肥厚指數(shù)均明顯高于正常對照組大鼠（P<0.01）。
　　結(jié)論：成功建立了肺動脈高壓大鼠模型，外周血和肺組織中HSP90表達升高，與肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。
　　第三部分 HSP90抑制劑17-DMAG對肺動脈高壓的治療作用
　　目的：評價HSP90抑制劑17-DMAG治療肺動脈高壓大鼠的安全性和有效性。
　　方法：1、按照第

11、二部分方法建立肺動脈高壓大鼠模型，肺動脈高壓大鼠隨機分為4組，即對照組、法舒地爾治療組（15mg/kg.d）、低劑量17-DMAG（5mg/kg.2d）治療組和高劑量17-DMAG（10mg/kg.2d）治療組。2、ELISA法檢測大鼠外周血中HSP90的濃度，實時定量PCR方法檢測肺組織中HSP90基因的表達。3、比較各組大鼠生存率。4、從眼眶或頸動脈取血，檢測白細胞、血漿總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及肌酐等生化指標，評價17-D

12、MAG的安全性。
　　結(jié)果：1、低劑量17-DMAG組和高劑量17-DMAG組大鼠外周血HSP90含量較對照組明顯降低，但肺組織中HSP90基因的表達無明顯變化。2、治療20天后，對照組、法舒地爾組、17-DMAG低劑量組和高劑量組大鼠的生存率分別為44.4%、77.8%、66.7%和30.0%。3、右心導(dǎo)管檢查顯示，17-DMAG治療組大鼠的右室收縮壓和平均肺動脈壓較對照組明顯降低（P<0.05），但法舒地爾組、高劑量17-DM

13、AG組、低劑量17-DMAG組之間，右室收縮壓和平均肺動脈壓無明顯差異（P>0.05）。4、外周血檢查顯示，與對照組相比，17-DMAG組大鼠白細胞、中性粒細胞及血漿總膽紅素無明顯差異（P>0.05），肌酐有上升的趨勢，但無顯著差異（P>0.05）；與對照組和法舒地爾組相比，17-DMAG組大鼠血漿谷丙轉(zhuǎn)移酶、谷草轉(zhuǎn)移酶也明顯升高（P<0.05），而且高劑量17-DMAG組也比低劑量17-DMAG組明顯升高（P<0.05）。
　　

14、結(jié)論：HSP90抑制劑17-DMAG對肺動脈高壓有一定的治療效果，可能是通過緩解肺血管增殖與重構(gòu)實現(xiàn)的，但該藥存在一定的安全性隱患。
　　第四部分 17-DMAG調(diào)控平滑肌細胞生長的作用機制
　　目的：探索HSP90抑制劑17-DMAG對肺動脈高壓血管重構(gòu)的作用機制。
　　方法：1、常規(guī)方法培養(yǎng)血管平滑肌細胞，利用不同濃度17-DMAG（0、50、200、500、1000nmol/L）處理，確定最佳的作用濃度。2、利用

15、MTT法，CCK8法確定17-DMAG對平滑肌細胞生長活力的影響。3、利用BrdU免疫熒光檢測17-DMAG對平滑肌細胞增殖的影響。
　　結(jié)果：1、不同濃度的17-DMAG處理平滑肌細胞后，細胞生長活力檢測顯示1000nmol/L的17-DMAG對VSMC的生長具有明顯的抑制作用（P<0.01），細胞數(shù)目為對照組的78.4%，并且這種抑制效果具有時間和劑量依賴性。2、1000nmol/L的17-DMAG處理平滑肌細胞24h后，與對

16、照組相比，細胞增殖水平明顯降低（P<0.01）。3、與對照組相比，17-DMAG處理的平滑肌細胞凋亡水平無明顯變化（P>0.05）。4、1000nmol/L的17-DMAG處理的平滑肌細胞生長停滯在細胞周期G1期。5、與對照組相比，17-DMAG處理的平滑肌細胞內(nèi)細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白D的表達明顯降低（P<0.01），而細胞周期蛋白E的表達無明顯變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：HSP90抑制劑17-DMAG影響細胞周期蛋白

17、的表達，使平滑肌細胞生長停滯在細胞周期G1期，從而抑制平滑肌細胞增殖，對肺動脈高壓發(fā)病過程中的血管重構(gòu)可能具有抑制作用。
　　總結(jié)：在肺動脈高壓患者中，外周血HSP90含量明顯增高，并且與腦鈉肽前體和白介素6的含量成正相關(guān)；在肺動脈高壓大鼠模型，外周血和肺組織HSP90表達也明顯增加，這提示HSP90含量的升高與肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。HSP90抑制劑17-DMAG能有效的降低肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓力，減輕肺血管增殖、