尼古丁在新生大鼠耳蝸毒性機(jī)制及17-DMAG的保護(hù)作用.pdf

1、第一部分：SD大鼠乳鼠耳蝸器官體外培養(yǎng)技術(shù)
　　目的：探討內(nèi)耳器官培養(yǎng)技術(shù)使毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元及聽神經(jīng)纖維在體外培養(yǎng)環(huán)境維持完整形態(tài)，為進(jìn)一步開展藥物的耳毒性及其保護(hù)性研究奠定了實驗技術(shù)的基礎(chǔ)。
　　方法：選用Sprague Dawley大鼠2-3天的新生乳鼠，解剖顯微鏡下解剖分離前庭器官膜、外側(cè)壁、基底膜。將基底膜分成三段，頂、中、底回三個節(jié)段，利用培養(yǎng)基的液體表面張力鋪放將基底膜和前庭器官等各個器官，平整向上平整鋪放在培

2、養(yǎng)皿表面，培養(yǎng)48小時后觀察基底膜形態(tài)并計數(shù)毛細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果：前庭毛細(xì)胞和耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛整齊排列，無紊亂，前庭毛細(xì)胞排列整齊無缺失，基底膜三個節(jié)段的三排外毛細(xì)胞和一排內(nèi)毛細(xì)胞沿柯替氏器螺旋器(OC，Organ of Corti)整齊排列，無缺失。螺旋神經(jīng)結(jié)細(xì)胞排列密集，呈橢圓形，細(xì)胞體積大，胞核清晰，聽神經(jīng)纖維排列整齊，無斷裂。
　　結(jié)論：運(yùn)用液體表面張力貼壁方法，可以在體外環(huán)境下獲得觀察方便、形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的的耳蝸器

3、官和組織。
　　第二部分：尼古丁對新生大鼠體外培養(yǎng)基底膜的毒性作用
　　目的：建立尼古丁耳毒性的體外培養(yǎng)損傷模型，探討尼古丁在耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)結(jié)細(xì)胞和神經(jīng)纖維及的毒性作用及劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　方法：分離培養(yǎng)2-3天SD大鼠耳蝸基底膜，按照不同作用濃度(0-100ng/ml)處理尼古丁24小時。對耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)結(jié)及聽神經(jīng)纖維絲采用免疫熒光染色進(jìn)行觀測，分別對毛細(xì)胞，螺旋神經(jīng)纖維和神經(jīng)元計數(shù)。對毛細(xì)胞、支持細(xì)胞及

4、毛細(xì)胞靜纖毛束的超微結(jié)構(gòu)使用掃描和透射電子顯微鏡觀察。
　　結(jié)果：通過對不同尼古丁濃度處理的毛細(xì)胞計數(shù)，毛細(xì)胞損失量隨尼古丁濃度的增加。尼古丁的內(nèi)、外毛細(xì)胞受到類似的損傷，毛細(xì)胞的損傷，且基底膜底回毛細(xì)胞較頂、中損傷嚴(yán)重。尼古丁的處理導(dǎo)致毛細(xì)胞胞漿空泡增多，靜纖毛束紊亂和缺失，線粒體數(shù)量減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹和脫顆粒改變。螺旋神經(jīng)元和聽神經(jīng)纖維未受到明顯損傷。
　　結(jié)論：尼古丁主要損害體外培養(yǎng)毛細(xì)胞，尼古丁所造成的毛細(xì)胞損傷模式有

5、耳蝸底回擴(kuò)展到頂、中回，尼古丁耳毒性呈劑量依賴關(guān)系，但對螺旋神經(jīng)元和聽神經(jīng)纖維無明顯損傷。
　　第三部分：格爾德霉素衍生物17-DMAG通過上調(diào)HSP70對新生大鼠耳蝸尼古丁毒性保護(hù)作用
　　目的：研究格爾德霉素衍生物17-DMAG在體外培養(yǎng)的環(huán)境下能否保護(hù)尼古丁引起的耳蝸毛細(xì)胞損傷。
　　方法：分離培養(yǎng)2-3天SD大鼠耳蝸基底膜，篩選出具有培養(yǎng)能夠保護(hù)毛細(xì)胞的17-DMAG處理濃度，基底膜分為空白對照組、單獨(dú)尼古丁處

6、理組和17-DMAG預(yù)處理5小時后尼古丁處理組。運(yùn)用ELISA和實時定量PCR檢測HSP70的蛋白和mRNA表達(dá)水平；通過熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測HSP70在離體培養(yǎng)基底膜的細(xì)胞定位，并對各組內(nèi)、外毛細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。
　　結(jié)果：在體外培養(yǎng)基底膜，HSP70主要定位于體外培養(yǎng)基底膜周圍部分新生的支持細(xì)胞及內(nèi)、外毛細(xì)胞的胞漿內(nèi)。17-DMAG誘導(dǎo)HSP70的蛋白和mRNA水平的表達(dá)上調(diào)。經(jīng)過17-DMAG預(yù)處理5小時后尼古丁處理，通過對

7、基底膜內(nèi)、外毛細(xì)胞計數(shù)，預(yù)處理組毛細(xì)胞數(shù)量大于單獨(dú)尼古丁處理組，兩者有顯著性差異(P<0.001)。17-DMAG能夠保護(hù)尼古丁對毛細(xì)胞的損傷。
　　結(jié)論：17-DMAG可通過上調(diào)HSP70蛋白及mRNA的表達(dá)水平對新生大鼠耳蝸毛細(xì)胞尼古丁損傷保護(hù)作用。17-DMAG可作為保護(hù)尼古丁導(dǎo)致的毛細(xì)胞損傷的耳毒性保護(hù)劑。
　　第四部分：鈣依賴性鉀通道BK在C57BL/6J小鼠耳蝸的年齡相關(guān)性表達(dá)及老年性聾的關(guān)系
　　目的：研

8、究C57BL/6J小鼠耳蝸鈣依賴性鉀通道BK年齡相關(guān)性表達(dá)，探討B(tài)K通道與老年性聾的關(guān)系。
　　方法：將小鼠按照年齡分為4、12、26和52周四個實驗組。利用免疫熒光組化技術(shù)定位BK通道在各個年齡段的小鼠耳蝸表達(dá)部位，熒光實時定量PCR法和免疫印記法檢測BK通道在mRNA和蛋白水平的在不同周齡組的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：免疫熒光提示：在各年齡段的小鼠耳蝸內(nèi)BK主要定位在毛細(xì)胞、耳蝸外側(cè)壁和螺旋神經(jīng)元。實時定量PCR法和免疫印記