17-AAG在SD大鼠短暫全腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：在臨床上，外科手術(shù)和心臟驟停導(dǎo)致的全腦低灌注是造成全腦缺血（Global cerebral ischemia，GCI)性損傷的重要原因。腦缺血后會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞的不可逆死亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)行為學(xué)上的障礙。在臨床上，全腦缺血會(huì)導(dǎo)致記憶學(xué)習(xí)能力下降、癡呆等后遺癥。因此，抑制神經(jīng)細(xì)胞的不可逆死亡有望成為改善腦功能的的重要突破口。
　　17-AAG(17-allylamino-demethoxygeldanamycin,

2、17-AAG)即17-丙烯胺基，17-去甲氧基格爾德霉素作為Hsp90抑制劑在臨床中是一種有效的抗腫瘤藥物。據(jù)報(bào)道，17-AAG可以通過(guò)提高Hsp70的表達(dá)水平來(lái)保護(hù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的腦損傷。因此，我們推測(cè)17-AAG在GCI中也可能具有重要的保護(hù)作用。
　　本研究首先探索17-AAG在大鼠GCI模型中的神經(jīng)保護(hù)作用；其次，分離培養(yǎng)大鼠的海馬神經(jīng)元，通過(guò)氧糖剝離/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfu

3、sion, OGD/R)模擬大鼠在體 GCI腦損傷，然后研究17-AAG對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用；最后，構(gòu)建Hsp90表達(dá)和Hsp70干擾慢病毒，探討17-AAG對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)作用的可能分子機(jī)制。
　　方法：（1）將90只雌性SD大鼠隨機(jī)的分成三組：假手術(shù)組（Sham）、全腦缺血再灌注組（ GCI）、全腦缺血再灌注加17-AAG處理組（17-AAG），通過(guò)四血管閉塞法構(gòu)建大鼠GCI模型。然后，通過(guò)TTC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組

4、大鼠腦梗死體積， TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡情況，水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力變化， Western blot檢測(cè)各組大鼠腦組織中Hsp70、Hsp90、LC3B的蛋白表達(dá)。
　?。?）分離培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，通過(guò) OGD/R模擬大鼠在體 GCI腦損傷，OGD時(shí)間為0.5h、1h、2h，再灌注時(shí)間為24h， TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OGD/R對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響，然后Western blot檢測(cè)OGD/R對(duì)各組細(xì)胞凋亡

5、標(biāo)志物Cleaved Caspase-3和自噬指標(biāo)LC3B II、p62表達(dá)的影響。
　　（3）通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的17-AAG（0.5μM、1.0μM、2.0μM）對(duì)OGD/R處理的神經(jīng)元的凋亡的影響，然后Western blot檢測(cè)凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3和自噬指標(biāo)LC3B II、p62表達(dá)的影響。然后，將細(xì)胞分為 OGD/R組、OGD/R+17-AAG（1.0μM）組、OGD/R+17-AAG

6、（1.0μM）+ Rapamycin（1.0nM）,通過(guò) TUNEL和Western blot研究自噬在17-AAG影響OGD/R處理的神經(jīng)元凋亡中的角色。
　?。?）通過(guò)Western blot研究17-AAG對(duì)OGD/R大鼠海馬神經(jīng)元中Hsp70和Hsp90表達(dá)的影響。構(gòu)建Hsp90表達(dá)和Hsp70干擾慢病毒，將細(xì)胞分成四組：OGD/R+17-AAG+Con、OGD/R+17-AAG+Hsp70 shRNA、OGD/R+17-

7、AAG+NC、OGD/R+17-AAG+Hsp90，通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)17-AAG是否通過(guò)Hsp90和Hsp70調(diào)節(jié)OGD/R大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，然后通過(guò)Western blot檢測(cè)17-AAG是否通過(guò)Hsp90和Hsp70調(diào)節(jié)OGD/R大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指標(biāo)Cleaved Caspase-3和自噬指標(biāo)LC3B II、p62的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）與GCI組相比，17-AAG組GCI導(dǎo)致的梗死體積明顯減少（P<0.01）,

8、神經(jīng)元存活明顯增加（P<0.01），大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶能力明顯改善（P<0.01，P<0.01），同時(shí)Hsp90和LC3B蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01，P<0.01），Hsp70蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01）。
　?。?）與Con組相比，OGD時(shí)間為1h和2h時(shí)，OGD/R能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡百分率的提高（P<0.05，P<0.01）；OGD時(shí)間為0.5h,1h和2h時(shí)，OGD/R均能夠明顯增強(qiáng)凋亡標(biāo)志物Cleaved

9、Caspase-3的表達(dá)（P<0.05，P<0.01，P<0.01）和自噬。
　　（3）與OGD/R1h相比，三種濃度的17-AAG（0.5μM、1.0μM、2.0μM）均可以降低 OGD/R神經(jīng)元的凋亡百分率（P<0.05，P<0.01，P<0.01）；17-AAG濃度為1.0μM、2.0μM時(shí)明顯減少OGD/R大鼠海馬神經(jīng)元Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)（P<0.01，P<0.01）和自噬。與OGD/R+17-A

10、AG組相比，OGD/R+17-AAG+ Rapamycin組神經(jīng)元自噬、凋亡的百分率和 Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)、均明顯升高（P<0.05， P<0.05）。
　　（4）與Con組相比，OGD/R組Hsp70的表達(dá)明顯降低（P<0.01），而Hsp90的表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與OGD/R組相比，OGD/R+17-AAG組細(xì)胞中Hsp70的表達(dá)明顯的升高（P<0.05），而Hsp90的表達(dá)明顯的降低（P<

11、0.05）。與OGD/R+17-AAG+Con相比，OGD/R+17-AAG+Hsp70 shRNA組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)和自噬均明顯提高（ P<0.01，P<0.05）；與OGD/R+17-AAG+NC組相比，OGD/R+17-AAG+Hsp90大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)和自噬也均明顯提高（P<0.01， P<0.05）。
　　結(jié)論：在GCI動(dòng)