GSK3β-β-catenin在低氧后處理對(duì)大鼠短暫全腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景與目的:我們之前的研究顯示,在成年雄性Wistar大鼠短暫全腦缺血(transient global cerebral ischemia,tGCI)10min后,間隔1-2d,給予持續(xù)60-120min濃度為8％的低氧,可以減少tGCI后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡。其中,間隔1d,120minHPC的保護(hù)作用最顯著,且至少可維持至缺血再灌注后30d。tGCI后0h,24h及144h,海馬CA1區(qū)p-Akt和FoxOs表達(dá)下降,低氧后處

2、理可使tGCI所致的Akt和FoxOs磷酸化水平增加。加入PI3K的抑制劑LY294002,可使Akt和FoxOs的磷酸化抑制,使大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷加重,使低氧后處理的神經(jīng)保護(hù)作用消失。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)為PI3K/Akt通路中的重要信號(hào)分子,GSK3β的表達(dá)既受其上游Akt的調(diào)控。GSK3β也通過(guò)Wnt信號(hào)通路影響其下游分子β-鏈蛋白(β-catenin)的

3、磷酸化,p-GSK3β可抑制β-catenin的磷酸化,并使β-catenin與GSK3β分離。分離后的β-catenin處于穩(wěn)定狀態(tài)并被激活,此時(shí),β-catenin在細(xì)胞漿中積聚并轉(zhuǎn)位到核內(nèi),進(jìn)一步影響下游靶基因如Bcl-2家族等的表達(dá)。低氧后處理減少大鼠tGCI后海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚未完全清楚。本研究在已經(jīng)建立的成年雄性Wistar大鼠tGCI低氧后處理的模型基礎(chǔ)上,分別觀察大鼠海馬CA1區(qū)在tGCI和低氧

4、后處理后GSK3β、β-catenin、Bcl-2、Bax的表達(dá)變化,旨在探索低氧后處理是否通過(guò)抑制GSK3β,活化β-catenin,抑制神經(jīng)元凋亡,從而對(duì)短暫全腦缺血的成年大鼠起神經(jīng)保護(hù)作用。
　　材料與方法:選取成年雄性Wistar大鼠(體重220-280g)。短暫全腦缺血模型按照改良的Pulsinelli經(jīng)典四血管阻塞模型進(jìn)行。低氧后處理的方法是在tGCI后24h,將大鼠放入密閉的防潮箱內(nèi),連續(xù)通入8%O2+92%N2混合

5、氣體2h。運(yùn)用免疫組化、Western blot等方法檢測(cè)GSK3β、β-catenin、Bax及Bcl-2在短暫全腦缺血及低氧后處理后海馬、皮層和紋狀體的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果顯示:與Sham組相比,單純低氧0h、24h海馬CA1區(qū)磷酸化GSK3β的表達(dá)變化不明顯。在tGCI組,CA1區(qū)p-GSK3β免疫陽(yáng)性細(xì)胞在再灌注0h開(kāi)始明顯減少(p<0.05),并維持至再灌注7d,缺血各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;tGCI后

6、給予大鼠低氧后處理,低氧后0h,24h和6d,可見(jiàn)錐體細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較再灌注26h,50h及7d組升高(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示:tGCI后4h,26h,50h,CA1區(qū)p-GSK3β表達(dá)量均降低,低于Sham組水平(p<0.05),但tGCI4h,26h和50h各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;給予低氧后處理后0h,24h,p-GSK3β與缺血組再灌注26h,50h相比表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。海馬

7、CA1區(qū)GSK3β在各組的表達(dá)與Sham組相比,無(wú)明顯變化(p>0.05)。免疫熒光雙標(biāo)顯示:成年大鼠Sham組海馬CA1區(qū)磷酸化GSK3β與神經(jīng)元胞漿標(biāo)記物MAP-2共表達(dá)。(2)單純低氧0h及24h與Sham組比較,p-β-catenin免疫陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯變化(p>0.05)。tGCI組再灌注7d,p-β-catenin免疫陽(yáng)性細(xì)胞急劇增多,高于Sham組水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。tGCI后給予大鼠低氧后處理,低氧后2

8、4h、6d與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的tGCI組比較,p-β-catenin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示,各組與Sham組相比,海馬CA1區(qū)β-catenin表達(dá)無(wú)明顯變化(p>0.05)。(3)免疫組化結(jié)果顯示,Bax免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在Sham組、單純低氧0h、24h組海馬輕度增多,與Sham組比較,單純低氧組及tGCI組再灌注0h、4hBax免疫陽(yáng)性表達(dá)變化不明顯(p>0.05)。與Sham組相比,tGCI組

9、在再灌注26h-50hBax免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,在再灌注7d達(dá)高峰(p<0.05)。tGCI后給予大鼠低氧后處理,Bax免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少,低氧后0h、24h、6d與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的tGCI組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Western blot結(jié)果顯示海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)量在再灌注26h最高(p<0.05),再灌注50h,Bax的表達(dá)量仍維持較高水平,但與再灌注26h相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予低氧后處理后,低氧

10、后24h與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的再灌注50h相比,Bax的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(4)Bcl-2免疫陽(yáng)性細(xì)胞在大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回及皮層分布。免疫組化結(jié)果顯示,tGCI后給予低氧后處理,Bcl-2免疫陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,低氧后6d組Bcl-2免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與缺血再灌注7d組及Sham組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　Western blot結(jié)果顯示,各組與Sham組相比,Bcl-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)