mPTP在腦缺血后處理保護效應機制中的作用研究.pdf

1、近來研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后，再灌注前，反復行數(shù)次短暫再灌注/缺血能明顯減輕腦的梗死容積，減少再灌注損傷，具有腦保護作用，此現(xiàn)象被稱為“缺血后處理”（Ischemic Postconditioning,IPost）。IPost作為減輕腦缺血再灌注損傷的新型干預措施，如何實施才能達到有效腦保護效應，目前仍未可知。
　　線粒體敏感性轉(zhuǎn)化孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore,mPTP）是線

2、粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道，在再灌注早期開放，可以誘導細胞的凋亡。心肌IPost的機制研究提示，mPTP在IPost對心肌的保護作用中扮演重要的角色，可能是IPost保護機制的共同通路，然而，mPTP在腦IPost的作用如何，目前仍需進一步的探索和研究。因此，本研究正是利用大鼠中動脈阻閉模型（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO），探尋和篩選腦IPost保護作用的有效時間，并且以mPTP為切入點

3、，初步探討腦IPost的保護機制。
　　第一部分，腦IPost保護作用的時間方案篩選及與缺血預處理比較
　　方法：
　　1.缺血后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用的時間方案篩選
　　健康雄性SD大鼠60只隨機分為6組：對照組（缺血90min）和IPost不同時間點組（缺血90min后，分別在15s/30s/1min/2min/5min進行再灌注/缺血處理，反復三次）。所有動物再灌注24h行神經(jīng)功能障礙評分

4、。24h后處死動物，TTC染色以確定梗死容積。
　　2.缺血后處理與缺血預處理腦保護效應的比較
　　30只SD大鼠隨機分為3組：對照組，IPost組和缺血預處理組（IschemicPretconditioning,IPC）組（缺血20min，再灌注24h后行MCAO90min）。所有動物再灌注24h行神經(jīng)功能障礙評分。24h處死動物，TTC染色確定梗死容積。
　　結(jié)果：
　　術(shù)后所有動物都存活。缺血再灌注后大鼠均

5、表現(xiàn)一定的神經(jīng)功能障礙。
　　1.缺血再灌注24h后，IPost-15s/30s/1min/2min組神經(jīng)功能障礙評分與對照組相比顯著降低，尤以IPost-15s組低于其它各組，而IPost-5min組與對照組相比較無統(tǒng)計學意義。再灌注24h腦梗死容積百分比：IPost-15s組，IPost-30s組，IPost-1min組和IPost-2min組分別明顯小于對照組，而IPost-5min組與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義。IPos

6、t-15s組腦梗死容積顯著小于其它各組。最后確定IPost-15s組做為后續(xù)實驗時間。
　　2.IPost組和IPC組神經(jīng)功能障礙評分顯著低于對照組。IPost組和IPC組腦梗死容積小于對照組。但IPost組腦梗死容積大于IPC組。
　　第二部分，mPTP在腦缺血后處理保護機制中的作用研究
　　方法：
　　1．mPTP開放劑蒼術(shù)苷最低有效劑量的篩選
　　再灌注前10min側(cè)腦室注射不同濃度的mPTP開放劑蒼

7、術(shù)苷（Atractyloside,Atr），以確定可以促使mPTP開放的最低有效劑量。
　　30只SD大鼠隨機分為3組：對照組，Atr-1組（4mmol/L，15μl），Atr-2組（2mmol/L，15μl）；再灌注24h行Garcia神經(jīng)功能行為學評分。24h后處死動物，TTC染色以確定梗死容積。
　　2．在體實驗確定mPTP在腦缺血后處理保護效應中的作用
　　利用側(cè)腦室注射mPTP的關(guān)閉劑環(huán)孢菌素A（Cyclos

8、porinA,CsA）和開放劑Atr來確定mPTP在腦IPost保護中的作用。
　　70只SD大鼠隨機分為7組。溶劑組（100％乙醇），對照組，對照組＋CsA（2μmol/L，15μl再灌注前10min給予），對照組＋Atr（再灌注前15min給予）；IPost組，IPost+CsA（2μmol/L，15μl再灌注前10min給予），IPost+Atr（再灌注前15min給予）。所有動物分別再灌注24h、48h和72h行Garci

9、a神經(jīng)功能行為學評分。72h后處死動物，TTC染色確定腦梗死容積。
　　3．透射電鏡下觀察腦缺血后處理保護效應中線粒體的超微結(jié)構(gòu)
　　實驗分組同實驗2，待模型制作成功后，再灌注72h后取損傷側(cè)海馬組織，通過透射電鏡觀察腦組織線粒體的超微結(jié)構(gòu)。
　　4.離體實驗近一步證實mPTP在腦缺血后處理保護效應中的作用
　　利用分光光度計檢測mPTP開放和關(guān)閉的程度。
　　70只SD大鼠隨機分為7組。90min單純?nèi)毖?/p>

10、組，其余分組同實驗2。所有動物于再灌注15min后提取線粒體，利用分光光度計在520nm波長下所測得吸光度值來檢測mPTP開放和關(guān)閉的程度。
　　結(jié)果：
　　1．缺血再灌注24h后，Atr-1組神經(jīng)功能行為學評分與對照組相比有顯著統(tǒng)計學差異。Atr-2組神經(jīng)功能行為學評分顯著大于Atr-1組。再灌注24h腦梗死容積百分比：Atr-1組明顯大于對照組，而Atr-2組腦梗死容積百分比顯著低于Atr-1組。最后確定Atr為2mmo

11、l/L，15μl作為后續(xù)實驗劑量。
　　2.在再灌注的各個時間點中，對照組＋CsA和IPost組神經(jīng)功能行為學評分顯著高于對照組。IPost+Atr神經(jīng)功能行為學評分與IPost組相比具有統(tǒng)計學意義。而IPost+CsA神經(jīng)功能行為學評分與IPost組相比無統(tǒng)計學意義。再灌注72h后，對照組＋CsA和IPost組的腦梗死容積顯著低于對照組。IPost+Atr腦梗死容積顯著大于IPost組。而IPost+CsA腦梗死容積與IPost

12、組相比無統(tǒng)計學意義。對照組和溶劑組之間無統(tǒng)計學差異。
　　3．通過透射電鏡可以觀察到正常線粒體呈桿狀，結(jié)構(gòu)完整，外膜平滑光整，線粒體嵴排列整齊，并且清晰可見；對照組和加入Atr組的線粒體結(jié)構(gòu)破壞嚴重，線粒體腫脹，線粒體嵴消失，內(nèi)部空泡化。而IPost組和加入CsA組線粒體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本完整，線粒體嵴排列整齊，線粒體膜清晰可見。
　　4.與單純?nèi)毖M相比，其它各組吸光度的改變值明顯升高；加入CsA組的吸光度改變值明顯低于對照組

13、；加入Atr組的吸光度改變值明顯高于IPost組。但IPost＋CsA與IPost組相比，吸光度的改變值無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.缺血后處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用時間為15s再灌注/缺血，反復三次。缺血后處理的腦保護效應略弱于缺血預處理。
　　2.腦缺血后處理可以抑制腦的缺血再灌注損傷，改善線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，最終起到腦的保護作用。
　　3.腦缺血后處理的部分機制可能是通過再灌注早期抑制