mTOR信號通路在17-DMAG克服EML4-ALK陽性肺癌細(xì)胞株H3122對alectinib耐藥中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察mTOR信號通路在17-DMAG克服旁路信號通路激活誘導(dǎo)棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4與間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因陽性肺癌細(xì)胞株H3122（簡稱“H3122細(xì)胞”）對alectinib耐藥中的變化，并探討其內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:加入100 ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)和100 ng/ml表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)H3122細(xì)胞對alectinib耐藥，觀察加入17-DMAG后上述耐藥能否被克服

2、。采用CCK-8法檢測不同處理方式下H3122細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測不同處理方式細(xì)胞中ALK、EGFR及磷酸化蛋白的表達(dá)，觀察其下游mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白及活化水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:Alectinib作用72 h后H3122細(xì)胞增殖率隨藥物濃度升高而下降，IC50為0.042μmol/L;聯(lián)合TGF-α或EGF后H3122細(xì)胞對alectinib不敏感，IC50

3、遠(yuǎn)大于10μmol/L;單藥17-DMAG處理后H3122細(xì)胞增殖率隨藥物濃度升高而下降，IC50為0.245μmol/L;聯(lián)合TGF-α或EGF后H3122細(xì)胞增殖率亦被17-DMAG抑制，且呈劑量依賴性，IC50分別為0.251μmol/L和0.301μmol/L。經(jīng)0.05μmol/L的alectinib作用72 h后H3122細(xì)胞凋亡率為(30.01±0.92)％，alectinib聯(lián)合TGF-α或EGF后的細(xì)胞凋亡率分別為(6

4、.36±0.14)％和（6.13±0.21）％，顯著低于alectinib單藥處理組;經(jīng)0.3μmol/L的17-DMAG單藥或聯(lián)合TGF-α、EGF作用72 h后H3122細(xì)胞凋亡率分別為(28.37±1.75)％、(26.69±1.2)％和(26.6240.72)％，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Alectinib可抑制H3122細(xì)胞中p-ALK、p-mTOR的表達(dá)，也可抑制mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白的活化狀態(tài); EGF可明顯增加細(xì)胞中p-

5、EGFR、p-mTOR及mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白的活化水平表達(dá);alectinib可抑制p-ALK表達(dá)，但聯(lián)合EGF后不能抑制mTOR及mTOR上、下游關(guān)鍵蛋白活化水平的表達(dá);即使聯(lián)合EGF后，17-DMAG亦能抑制H3122細(xì)胞中ALK、EGFR、mTOR信號通路蛋白及其活化狀態(tài)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:旁路信號通路激活介導(dǎo)EML4-ALK融合基因陽性肺癌細(xì)胞株H3122對alectinib耐藥的方式具有可行性，mTOR信號通路在