Rho激酶抑制劑法舒地爾對低氧性肺動脈高壓大鼠干預作用的研究.pdf

1、低氧性肺動脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension,HPH)是一些心肺血管疾病最常見的并發(fā)癥，以肺動脈壓力增高、肺血管結構重建和右心室肥厚為特征，如不干預，病情日益加重，可導致右心衰竭而死亡。目前其發(fā)病機制尚不完全清楚，臨床上也缺乏理想的治療藥物。因此，對HPH形成機制的研究及其研發(fā)有效的防治HPH的藥物顯得尤為必要。HPH是一個由多種分子和多種靶細胞相互作用的復雜過程，而其中何種因素在HPH的發(fā)生與發(fā)展階段起關

2、鍵作用，尚無明確的結論。近年來，Rho/Rho激酶信號轉導通路與心肺血管疾病之間的關系受到了日益廣泛的關注。有研究表明，選擇性阻斷該信號通路可以改善心肺血管損傷的進展和預后，然而其確切的作用機制尚不清楚。 本研究觀察Rho激酶抑制劑法舒地爾對低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管結構變化的影響，并應用逆轉錄聚合酶鏈反應以及蛋白免疫印跡技術，從基因和蛋白質水平研究Rho激酶抑制劑法舒地爾對Rho/Rho激酶信號通路的作用及其機制，并研究該信號

3、通路與HPH形成與發(fā)展的相關性，為研發(fā)新一代治療藥物提供有益的靶標，也為臨床治療HPH提供實驗及理論依據(jù)。 第一部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對低氧性肺動脈高壓大鼠的作用——血流動力學與病理學研究 目的：建立低氧性肺動脈高壓(HPH)大鼠模型，探討HPH形成的病理機制，研究Rho激酶抑制劑法舒地爾對大鼠形成HPH過程中肺動脈壓增高及肺血管結構重建的影響。 方法：72只雄性SD大鼠，隨機均分為正常對照組、低氧模型組和

4、法舒地爾干預組。采用常壓間斷低氧法[(10±0.5)﹪O2，每天間斷低氧8小時，每周6天，共21天]建立大鼠HPH模型。分別于低氧不同階段(第3天、7天、14天和21天)測定各組大鼠平均肺動脈壓力(meanpulmonaryarterypressure,mPAP)、平均頸動脈壓力(meancervicalarterialpressure,mCAP)、右心室肥厚指數(shù)(rightventricularhypertrophyindex，RVH

5、I)；光鏡下結合圖像分析進行肺血管結構重建觀察；透射電鏡觀察肺小動脈內皮細胞超微結構的變化。 結果：(1)低氧7天起模型組大鼠mPAP、肺小動脈管壁厚度/外徑(WT﹪)、管壁面積/管總面積(WA﹪)、管腔面積/管總面積(LA﹪)、肌型動脈占位比、非肌型動脈占位比、中膜細胞核數(shù)密度分別為(19.50±0.95)mmHg、(19.75±3.41)﹪、(36.92±4.19)﹪、(60.38±4.19)﹪、(24.83±2.48)﹪、

6、(59.34±6.12)﹪、(8.17±1.17)與對照組(15.75±1.16)mmHg、(12.96±2.21)﹪、(31.42±3.61)﹪、(68.58±3.61)﹪、(8.50±1.38)﹪、(76.00±4.34)﹪、(5.83±0.75)比較差異有顯著性(P均＜0.05)，并隨低氧時間延長日趨明顯；低氧14天RVHI為(35.56±2.39)﹪與對照組(24.60±2.14)﹪比較明顯升高(P＜0.01)。(2)法舒地爾干

7、預組大鼠在低氧7天后mPAP、WT﹪、WA﹪、LA﹪、肌型動脈占位比、非肌型動脈占位比、肺血管中膜細胞核數(shù)密度分別為(16.00±0.91)mmHg、(15.32±2.20)﹪、(34.20±4.87)﹪、(65.80±4.87)﹪、(9.66±1.21)﹪、(74.67±3.93)﹪、(6.50±1.52)與模型組(19.50±0.95)mmHg、(19.75±3.41)﹪、(36.92±4.19)﹪、(60.38±4.19)﹪、(2

8、4.83±2.48)﹪、(59.34±6.12)﹪、(8.17±1.17)比較差異均有顯著性(P均＜0.05)；法舒地爾干預組低氧14天RVHI為(26.61±1.26)﹪與模型組(35.56±2.39)﹪比較顯著降低(P＜0.01)。(3)各組間mCAP無顯著性差異(P均＞0.05)。(4)透射電鏡結果顯示模型組大鼠低氧早期肺小動脈內皮細胞結構即受到明顯損傷，以線粒體損傷改變最為明顯，且隨低氧時間延長而加重，后期內皮細胞周圍平滑肌細胞

9、增生、腫脹，膠原纖維增生；法舒地爾干預組肺小動脈內皮細胞損傷、平滑肌細胞及膠原纖維增生均明顯減輕。 結論：Rho激酶抑制劑法舒地爾能夠預防常壓低氧狀態(tài)導致的肺動脈高壓的形成與發(fā)展，其機制在于降低肺動脈高壓和抑制肺血管結構重建。 第二部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織Rho/Rho激酶表達及干預影響 目的：探討Rho激酶抑制劑法舒地爾對低氧性肺動脈高壓(HPH)大鼠不同階段肺組織Rho/Rho

10、激酶的表達及干預影響。 方法：72只雄性SD大鼠，隨機均分為正常對照組、低氧模型組和法舒地爾干預組。采用常壓間斷低氧法建立大鼠HPH模型。半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定各組大鼠肺組織Rho激酶及成肌纖維細胞標志基因α-平滑肌肌動蛋白(smoothmusclealpha-actin,α-SMA)mRNA表達水平；免疫印跡法(Westernblot)檢測各組大鼠肺組織Rho激酶蛋白的表達水平，并檢測Rho激酶底物——肌

11、球蛋白磷酸酶結合亞單位第697位蘇氨酸(MBSThr-697)的磷酸化水平，作為Rho/Rho激酶信號轉導通路活化指標。將上述指標與肺動脈壓力(mPAP)及右心室肥厚指數(shù)(RVHI)進行相關分析，了解該信號通路的活性與肺動脈高壓進展之間的關系。 結果：Rho激酶mRNA和蛋白在HPH發(fā)生早期即明顯上調，至模型后期仍維持于較高水平，肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平也較對照組顯著增高(P均＜0.01)，并與mPAP及RVHI均呈明顯正相關(

12、P均＜0.01)；Rho激酶mRNA表達較成肌纖維細胞標志基因α-SMA提前達到高峰，二者呈顯著正相關(r=0.883，P＜0.05)；法舒地爾干預后Rho激酶mRNA和蛋白、肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平、α-SMAmRNA均明顯降低。 結論：(1)HPH大鼠肺組織中存在Rho激酶的表達上調與功能活化，提示Rho/Rho激酶信號轉導通路參與HPH的形成過程，并且可能通過調節(jié)成肌纖維細胞的增生來發(fā)揮作用。(2)Rho激酶抑制劑法舒地爾