雙氫青蒿素對(duì)肺動(dòng)脈高壓干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種臨床進(jìn)展性疾病，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈阻力進(jìn)行增高進(jìn)而導(dǎo)致右心衰，死亡率高;病理特征為內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞增殖，中膜肥厚，原位血栓形成。目前治療PAH的藥物主要包括鈣離子拮抗劑、前列環(huán)素類藥物、內(nèi)皮素受體阻滯劑、磷酸二酯酶抑制劑-5等，這些藥物主要通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制阻斷肺動(dòng)脈收縮、擴(kuò)張肺動(dòng)脈發(fā)揮其治療作用，雖然對(duì)早期患者可改善其癥狀

2、，但不能逆轉(zhuǎn)其病程，療效有限，且價(jià)格昂貴。因此尋找療效確切，價(jià)格低廉，適合我國(guó)國(guó)情的藥物有極其重要的意義。青蒿素(artemisinine，Art)屬倍半萜內(nèi)酯化合物，是一種高效低毒的抗瘧藥物，其衍生物主要有雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）、青蒿琥酯(artesunate)、蒿甲醚(artemether)和蒿乙醚（arteether）等，臨床上主要用于治療瘧疾。新近研究表明，除抗瘧作用外，青蒿素還具有抗炎、抗腫

3、瘤、放射增敏、抗菌增敏、抗組織纖維化等作用。青蒿素能否通過(guò)抗纖維化或其他機(jī)制，抑制肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中的肺動(dòng)脈重構(gòu)，進(jìn)而對(duì)肺動(dòng)脈高壓產(chǎn)生保護(hù)作用。目前，這方面的研究鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素在體內(nèi)的主要代謝物，與青蒿素比較，DHA具有水溶性更好，生物利用度更高，抗瘧效力更強(qiáng)的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)野百合堿建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，應(yīng)用DHA對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓進(jìn)行干預(yù)，探討DHA對(duì)肺高壓大鼠血流動(dòng)

4、力學(xué)及肺血管重構(gòu)的影響;探討DHA對(duì)MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及右室心肌細(xì)胞凋亡的影響;探討DHA對(duì)野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠VEGF、ICAM-1、表達(dá)的影響。研究DHA對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制。
　　目的：
　　觀察雙氫青蒿素對(duì)野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈壓力的作用，探討雙氫青蒿素對(duì)野百合堿肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1雙氫青蒿

5、素對(duì)肺高壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)及肺血管重構(gòu)的影響
　　將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肺動(dòng)脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預(yù)組，每組10只。肺動(dòng)脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預(yù)組給予野百合堿60mg/kg皮下注射，建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，正常對(duì)照組給予等劑量的生理鹽水（60mg/kg，約6ml/kg）皮下注射。3周后，干預(yù)組每天給予雙氫青蒿素（溶于植物油中）60mg/kg/d灌胃，其余兩組給予等劑量的淀粉溶液灌胃，持續(xù)3周后進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)

6、檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察;以導(dǎo)管法觀察其平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）、組織病理學(xué)檢查觀察新生內(nèi)膜形成、計(jì)算右心室肥大指數(shù)即右心室/左心室+室間隔（RV/LV+S）的變化;評(píng)價(jià)肺動(dòng)脈管壁厚度和管腔面積;免疫組化染色計(jì)算肺小動(dòng)脈無(wú)肌性血管肌化程度、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖度、VG染色評(píng)價(jià)新生內(nèi)膜細(xì)胞的增殖度;天狼猩紅染色評(píng)價(jià)心肌膠原沉積。
　　2雙氫青蒿素對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及右室心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　將30只

7、雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肺動(dòng)脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預(yù)組，每組10只，動(dòng)物模型的制備及分組同第一部分。游離右心室，取右室游離壁中部1mm3心肌標(biāo)本2～3塊，立即行2.5％戊二醛-1％鋨酸雙固定;常規(guī)乙醇、丙酮逐級(jí)脫水;環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，以H-500透射電鏡觀察并拍照以觀察MCT誘導(dǎo)的大鼠右室心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　采用TUNEL法檢測(cè)，參照In situ Cell Dea

8、th Dection，POD Kit說(shuō)明操作。常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水;3％甲醇過(guò)氧化氫阻斷POD;蛋白酶K37℃孵育，加入TUNEL液(1∶9); POD轉(zhuǎn)換液;DAB顯色，蘇木素復(fù)染;晾干，封片，鏡檢。光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)算右室心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。
　　3.雙氫青蒿素對(duì)野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠VEGF、ICAM-1表達(dá)的影響
　　將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肺動(dòng)脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預(yù)組，每組10只，動(dòng)物模型

9、的制備及分組同第一部分。采用放射免疫分析法測(cè)定血液中VEGF、ICAM-1等因子的含量;應(yīng)用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)肺動(dòng)脈中VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、野百合堿皮下注射可引起大鼠嚴(yán)重肺高壓形成，并出現(xiàn)新生內(nèi)膜，肺動(dòng)脈高壓組mPAP、右心室重量、腺泡內(nèi)肺小動(dòng)脈肌化程度、肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比、肺小動(dòng)脈新生內(nèi)膜增殖度較其它各組顯著升高(P＜0.01)。經(jīng)雙氫青蒿素干

10、預(yù)后，mPAP有所下降、右室肥大指數(shù)、肺小動(dòng)脈肌化程度、肺小動(dòng)脈中膜厚度及新生內(nèi)膜增殖度均有所減輕(P＜0.05)。
　　2、各實(shí)驗(yàn)組右室心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)所見(jiàn):正常對(duì)照組肌絲排列整齊，肌小節(jié)Z線、M線清晰可見(jiàn)，心肌細(xì)胞核膜清晰，核結(jié)構(gòu)完整，線粒體飽滿，嵴完整。模型組肌絲大量斷裂、溶解，線粒體腫脹，部分嵴斷裂并伴有明顯空泡樣變性;心肌細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、染色質(zhì)邊集濃聚;雙氫青蒿素干預(yù)組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組為輕，肌絲排列尚整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)

11、基本清晰，線粒體輕度腫脹。經(jīng)TUNEL法檢測(cè)，青蒿素干預(yù)組，心肌細(xì)胞凋亡程度較模型組有所減輕(P＜0.05)。
　　3、各組大鼠血清中均可測(cè)到不同濃度的VEGF、ICAM-1，與模型組相比，雙氫青蒿素干預(yù)組內(nèi)VEGF、ICAM-1的濃度明顯低于模型組(P＜0.05)。
　　各組肺動(dòng)脈內(nèi)均可見(jiàn)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組內(nèi)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜

12、0.01)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)組內(nèi)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與肺動(dòng)脈高壓組相比，干預(yù)組內(nèi)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯低于肺動(dòng)脈高壓組(P＜0.05)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、雙氫青蒿素可直接降低MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型大鼠的肺動(dòng)脈壓、明顯抑制其肺血管構(gòu)型重建、減輕右心室肥厚。
　　2、雙氫青蒿素可抑制或