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1、目的:當(dāng)前,伴隨著我國(guó)人口老齡化問題的急劇加重,一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)的發(fā)病率日益增加。這些疾病不僅嚴(yán)重威脅著老年人口的生命健康,而且極大地增加了社會(huì)負(fù)擔(dān)。在此類疾病的治療上,中西醫(yī)結(jié)合的方法目前越來越顯示出其優(yōu)越性。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)生,病機(jī)雖較復(fù)雜,但歸納起來不外乎內(nèi)因和外因兩方面,而且內(nèi)外因在一定條件下相互影響、相互作用。中醫(yī)結(jié)合現(xiàn)代研究成果認(rèn)為,中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病位雖在腦髓
2、,但是由于臟腑經(jīng)絡(luò)、陰陽氣血失調(diào)所致。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,中醫(yī)的治療原則是遵循整體觀念與辨證論治宗旨,根據(jù)“急則治其標(biāo)、緩則治其本”及“異病同治、同病異治”的原則,與西醫(yī)治療相結(jié)合,貫穿于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)修復(fù)的全過程?!案文I與腦相關(guān)”的認(rèn)識(shí)由來已久。腎主骨生髓,輸精髓以充盈腦海,為腦活動(dòng)提供了物質(zhì)基礎(chǔ);“腎藏精、精生髓、髓充腦、腦主元神”。腎腦結(jié)構(gòu)上相互聯(lián)屬,從經(jīng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上,腦與腎在體表通過督脈和足太陽膀胱經(jīng)相互溝通,在里腎主骨生髓,
3、髓充為腦,通過骨、髓發(fā)生聯(lián)系。腦與腎是腦與臟腑間關(guān)系最為密切的一對(duì)。經(jīng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上所形成的“腦—督脈—腎”子午線,是人體生命活動(dòng)的根本,故又稱為“生命線”。由此可見,中醫(yī)理論歷來有“肝腎與腦相關(guān)”的認(rèn)識(shí)。山茱萸作為補(bǔ)益肝腎的代表中藥,在臨床有著較好的療效,我國(guó)自古就有山茱萸應(yīng)用于糖尿?。ㄖ嗅t(yī)稱為“消渴癥”)治療的記載?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,山茱萸屬植物中含有揮發(fā)性成分、環(huán)烯醚萜類成分、鞣質(zhì)和黃酮等4大類成分,還含有大量的小分子化合物和有機(jī)酸,
4、5-羥甲基糠醛(5-Hydroxy-methylfurfural,5-HMF)即為其中一種。通過前期研究(“山茱萸炮制機(jī)理研究”,國(guó)家科技部“十五”攻關(guān)課題2001BA701A11),明確了山茱萸酒蒸后藥效增強(qiáng),其中補(bǔ)益肝腎作用更加明顯,山茱萸制品總提液石油醚萃取部位、醇沉多糖部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位等為山茱萸炮制增效的活性部位,初步了解了這幾個(gè)溶劑萃取部位的化學(xué)成分,明確山茱萸炮制前后沒食子酸、維生素E、5-羥甲基糠醛等
5、含量明顯增加。近年來的研究表明:5-羥甲基糠醛具有增強(qiáng)大鼠紅細(xì)胞變形活性及抗氧化、改變血液流變學(xué)等對(duì)人體有益的作用。對(duì)由H2O2和葡萄糖所致?lián)p傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用,可逆轉(zhuǎn)SOD活力減低,推測(cè)抗氧化作用可能是其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制之一。因此,本研究在前期課題“山茱萸炮制機(jī)理研究”和“山茱萸活性部位、成分對(duì)衰老及相關(guān)模型影響的研究”(國(guó)家自然科學(xué)基金,30772851)的基礎(chǔ)上,基于中醫(yī)“腎腦相關(guān)”的理論基礎(chǔ),開展對(duì)我國(guó)滋陰補(bǔ)腎
6、經(jīng)典藥材山茱萸的活性成分——5-羥甲基糠醛(5-HMF)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)理研究。此研究對(duì)闡明5-HMF的藥理作用,特別是其存在或產(chǎn)生對(duì)中藥及其復(fù)方療效的影響有一定的意義。
方法:采用大、中、小三個(gè)不同劑量的山茱萸水煎液灌胃家兔,通過抽提灌胃后家兔的腦脊液,分別運(yùn)用HPLC和UPLC—MS兩種方法,來檢測(cè)家兔腦脊液中5-HMF的含量。透射電鏡下觀察空白對(duì)照組、H2O2模型組和加藥組(大、中、小三個(gè)劑量5-HMF)的海馬細(xì)
7、胞形態(tài)并拍照。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空白對(duì)照組、H2O2模型組和加藥組的細(xì)胞活力。利用2,4-二硝基苯肼反應(yīng)和黃嘌呤氧化酶法分別檢測(cè)空白對(duì)照組、模型組和加藥組內(nèi)LDH、SOD的變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。Real time-PCR對(duì)bcl-2、p53、Bax和caspase-3等與凋亡相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),Western blot對(duì)bcl-2、p53、Bax和caspase-3等基因蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果:
8、通過HPLC,在山茱萸水煎液大劑量組灌胃后所取家兔腦脊液中能檢測(cè)出5-HMF,而中、小劑量組灌胃后所取家兔腦脊液未能檢測(cè)出5-HMF。而運(yùn)用UPLC—MS分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大、中、小三個(gè)劑量組的腦脊液中都能檢測(cè)到5-羥甲基糠醛。電鏡下,空白對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)正常,核膜完整,染色質(zhì)分布均勻;神經(jīng)元內(nèi)多數(shù)線粒體正常。模型組可見細(xì)胞核明顯固縮,核膜不完整,胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡;神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹,嵴斷裂變化明顯。5-HMF大劑量組(終濃度10um
9、ol/L)可見胞質(zhì)內(nèi)有少量空泡,核膜基本完整;神經(jīng)元內(nèi)部分線粒體腫脹。而5-HMF中、小劑量組電鏡下未見明顯改變。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H2O2可引起模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞活性降低,與空白對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05),而5-HMF大劑量組、中劑量組可抑制過氧化氫損傷引起的活性降低(P<0.05),5-HMF小劑量組與模型組相比無顯著差異(P>0.05)。LDH、SOD檢測(cè)結(jié)果表明,模型組細(xì)胞LDH活性比空白對(duì)照組有明顯升高(P<0.
10、01),而5-HMF大、中劑量組使得H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯下降(P<0.01);模型組細(xì)胞SOD活性比空白對(duì)照組有明顯下降(P<0.05),而5-HMF大、中劑量組使得H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性顯著升高(P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組細(xì)胞凋亡率比空白對(duì)照組有明顯升高,而5-羥甲基糠醛大、中劑量組對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率有明顯的抑制作用,也反映了一定程度的保護(hù)作用。Realt
11、ime-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,caspase-3模型組與空白對(duì)照組相比,有顯著性差異(P<0.05),bax,p53,和bcl-2模型組與空白對(duì)照組相比,差異極顯著(P<0.01);5-HMF大劑量組作用后,bax,p53,和bcl-2與模型組相比,差異極顯著(P<0.01),而caspase-3與模型組相比,無顯著差異;5-HMF中劑量組作用后,bax和bcl-2與模型組相比,差異極顯著(P<0.01),p53與模型組相比,有顯著性差異
12、(P<0.05),而caspase-3與模型組相比,無顯著差異。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,bax,p53,bcl-2和caspase-3模型組與空白對(duì)照組相比,有顯著性差異(P<0.05);5-HMF大、中劑量組(10uM、1uM)作用后,bax,p53,bcl-2和caspase-3的蛋白表達(dá)水平與模型組(model)相比,差異極顯著(P<0.01)。
結(jié)論:根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們得出如下結(jié)論:①5-羥甲基糠醛能
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