DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)及修復(fù)作用研究.pdf

1、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）作為機(jī)體內(nèi)重要的一種甾體類化合物，是體內(nèi)各種類固醇激素合成的重要前體。DHEA與其他類固醇激素最大的不同之處在于其血漿中的濃度會隨著年齡的增長下降明顯，故推測DHEA的減少與機(jī)體衰老密切相關(guān)。H2O2作為活性氧在體內(nèi)的主要存在形式，其極易透過細(xì)胞膜對細(xì)胞造成損傷。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是合成和分泌雄激素的主要場所，而睪酮作為雄性動物體內(nèi)最重要的雄激素，其含量的95％是由睪丸間質(zhì)細(xì)

2、胞分泌的。已有研究表明，外源性DHEA對H2O2引起的細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)和修復(fù)作用，但其具體機(jī)制還不是很清楚。因此，本試驗(yàn)在建立一種可靠的H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷模型基礎(chǔ)之上，探討外源性DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能、核DNA損傷以及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響;在證實(shí)DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能及核DNA損傷具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用基礎(chǔ)之上，重點(diǎn)從基因和蛋白水平上檢測DH

3、EA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡途徑中相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化的影響，進(jìn)而深入探討PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞凋亡過程中的作用，研究旨在揭示DHEA在降低H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡過程中的作用，從而為深入闡明DHEA的抗氧化損傷作用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1、H2O2誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷模型的建立
　　為了建立體外模擬氧自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型，本試驗(yàn)采用Perco

4、ll密度梯度離心法純化原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，并鑒定特異性蛋白3β-HSD;采用MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、ROS以及O2-含量，比色法測定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性。結(jié)果顯示:特異性蛋白3β-HSD鑒定后，熒光顯微鏡觀察到大部分細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光。MTT測定結(jié)果顯示，300～1000μmol/L H2O2處理Leydig細(xì)胞均可極顯著降低細(xì)胞活力(P＜0

5、.01);300μmol/L H2O2處理可顯著升高Leydig細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05）以及增加ROS含量(P＜0.05)和·OH含量(P＜0.01），但可顯著降低線粒體膜電位(P＜0.05)。 H2O2處理對細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性無顯著影響(P＞0.05)，但可顯著升高細(xì)胞內(nèi)MDA的含量（P＜0.05）。結(jié)論:300μmol/LH2O2處理Leydig細(xì)胞8h可以誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，成功建立了體外模擬氧自由

6、基誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷模型。
　　2、DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究
　　本試驗(yàn)以原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對象，以300μmol/LH2O2為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探討外源性DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響。用含DHEA終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的培養(yǎng)液孵育原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24h以含0.1％D

7、MSO作為對照組;;之后各處理組用終濃度為300μmol/L的H2O2培養(yǎng)液誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞8h，收集細(xì)胞，待測。采用MTT法檢測細(xì)胞活力、放射免疫分析法檢測睪酮含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、ROS和O2-含量，比色法測定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性，單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測核DNA損傷，Real-time PCR法檢測OGG1、Bcl-2、Bax、caspase-9

8、、caspase-3、caspase-7mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，與損傷對照組相比，DHEA處理可顯著提高細(xì)胞活力(P＜0.05），并同時(shí)可恢復(fù)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的生物學(xué)功能(P＜0.01); DHEA處理可顯著降低細(xì)胞ROS含量(P＜0.05)、MDA含量(P＜0.05)和·OH含量(P＜0.01）; DHEA處理可顯著提高細(xì)胞POD活性(P＜0.05），但顯著降低細(xì)胞GSH-Px活性(P＜0.05）;不同濃度的DH

9、EA處理對細(xì)胞O2-含量、SOD及CAT活性并無顯著影響(P＜0.05）。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力下降和分泌睪酮功減弱起到一定保護(hù)作用;對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能減弱的保護(hù)作用是通過增強(qiáng)POD活性，減少·OH及由其攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生的MDA含量，最終降低機(jī)體內(nèi)ROS的含量，并增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性來實(shí)現(xiàn)的。
　　與損傷對照組相比，DHEA處理可顯著降低細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）和

10、極顯著降低細(xì)胞核DNA Olive尾矩（P＜0.01）;DHEA處理可顯著提高OGG1 mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)，同時(shí)可顯著降低Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7 mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞核DNA損傷具有一定保護(hù)作用，主要是通過增強(qiáng)OGG1 mRNA水平表達(dá)來實(shí)現(xiàn);DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用主要是降低凋亡

11、基因Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7 mRNA表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2比值，最終減少細(xì)胞凋亡。
　　3、DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用及其機(jī)制研究
　　本試驗(yàn)以原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對象，以300μmol/L H2O2為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探討外源性DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能、細(xì)胞凋亡的影響及其細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的研究。用含H2O

12、2終濃度為300μmol/L的培養(yǎng)液誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞8h，造成睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化損傷后，再用含DHEA終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的培養(yǎng)液孵育原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24h，以含0.1％DMSO作為對照組，收集細(xì)胞，待測。采用MTT法檢測細(xì)胞活力、放射免疫分析法檢測睪酮含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、ROS和O2-含量，比色法測定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶活性

13、，單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測核DNA損傷，Real-time PCR法檢測DNA損傷的修復(fù)基因以及細(xì)胞凋亡基因mRNA表達(dá)水平的變化，western blot檢測細(xì)胞凋亡途徑中關(guān)鍵因子的表達(dá)變化。結(jié)果表明，與損傷對照組相比，DHEA處理可極顯著提高細(xì)胞活力(P＜0.01)，并可恢復(fù)原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的生物學(xué)功能(P＜0.01); DHEA處理可極顯著降低細(xì)胞ROS和·OH的含量(P＜0.01); DHEA處理可顯著提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)S

14、OD、CAT和POD活性（P＜0.05），同時(shí)DHEA處理可顯著降低細(xì)胞MDA含量(P＜0.05）。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力下降和睪酮分泌功能的降低起到一定修復(fù)作用;對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗氧化功能減弱的修復(fù)作用是通過增強(qiáng)SOD、CAT及POD活性，減少·OH及由其攻擊細(xì)胞膜產(chǎn)生的MDA含量，最終降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量并增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性實(shí)現(xiàn)的。
　　與損傷對照組相比，DHEA處理

15、可顯著降低細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)和極顯著降低細(xì)胞核DNA Olive尾矩(P＜0.01); DHEA處理可顯著提高細(xì)胞線粒體膜電位(P＜0.05）;不同濃度的DHEA處理可顯著提高細(xì)胞OGG1、PI3K、Akt和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平(P＜0.05），同時(shí)可顯著降低細(xì)胞Bax、caspase-9、caspase-3和caspase-7 mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。 Western blot分析結(jié)果表明，DHEA處理可顯著

16、提高睪丸間質(zhì)細(xì)胞PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平(P＜0.05），且可顯著降低細(xì)胞Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）;在加入PI3K抑制劑(LY294002)處理后，DHEA處理可顯著降低細(xì)胞PI3K(P＜0.05），但對p-Akt、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平并未發(fā)現(xiàn)顯著影響。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)作用是通過增強(qiáng)OGG1mRNA水平表達(dá)來實(shí)現(xiàn);DHEA對H2O