構(gòu)建OECs-VEGF165基因工程細胞的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦白質(zhì)疏松癥的高發(fā)生率與治療滯后
　　 隨著人口老齡化的日益加劇、人們保健意識的增強以及影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腦白質(zhì)疏松癥(Leukoaraiosis，LA)也備受關(guān)注，它是老年人認知障礙最常見的原因之一，正常老年人的發(fā)病率為1.7-8.6％，高血壓患者為78％-93％，Alzheimer氏病為30％-31％，腦卒中病人為36％-100％。LADIS(Leukoaraiosis and Disability

2、in the Elderly)研究發(fā)現(xiàn)：在沒有殘疾的老年人中，機體能力的水平和腦白質(zhì)損害的程度相關(guān)，LA白質(zhì)損害的程度和癡呆殘疾評估分數(shù)密切相關(guān)。目前多數(shù)學(xué)者認為LA是由于年齡、高血壓及其他血管病危險因素造成腦內(nèi)小動脈發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，最終導(dǎo)致的腦部缺血性損傷。高血壓、老齡的LA的最主要危險因素。
　　 LA作為一種慢性血管性缺血性病癥，腦缺血后的神經(jīng)發(fā)生和血管發(fā)生是由缺血引發(fā)的腦內(nèi)兩個主要病理生理過程，兩者在促進缺血性損傷后的神經(jīng)

3、功能恢復(fù)方面都有重要作用。只有從改善局部的血管供血，才能從根本上解決LA發(fā)生發(fā)展的病因，阻止其向更嚴重(癡呆、腦梗塞)的病情發(fā)展。
　　 血管內(nèi)皮生長因子的研究進展和分析
　　 治療性血管再生(therapeutic angiogenesis)是近年提出的一個新概念，率先在心肌缺血方面被重點研究，指刺激心肌缺血區(qū)的小血管生長和促進側(cè)枝循環(huán)形成，即心肌缺血區(qū)的“自我搭橋”。目前認為，血管內(nèi)皮生長因子(vascular en

4、dothelialgrowth factor，VEGF)是最有效的刺激血管生長的細胞因子之一，VEGF的生物學(xué)功能和可使新生血管形成的特性己引起越來越多人的關(guān)注，國外有人把VEGF基因治療稱為“分子搭橋術(shù)”，有望部分取代外科搭橋術(shù)和血管成形術(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后VEGF及其受體的表達上調(diào)，腦內(nèi)注射VEGF導(dǎo)致腦部新生血管的形成和VEGFR-1在星形細胞的表達，VEGF還可直接發(fā)揮神經(jīng)保護作用而不依賴血管形成，有助于皮質(zhì)神經(jīng)元免受低氧和

5、低糖的損害，刺激軸突的生長。
　　 有關(guān)LA病變內(nèi)VEGF變化及對LA的治療國內(nèi)外未見報道。VEGF在心腦血管方面的成功實驗，為我們對LA的研究打下堅實的基礎(chǔ)。如何應(yīng)用外源性VEGF蛋白及VEGF基因治療腦血管病，改善受損腦組織的血液供應(yīng)，減輕其缺血程度，尚需進一步探索。LA的病理改變主要表現(xiàn)為缺血性脫髓鞘、髓鞘含量下降，如果能使局部的髓鞘再生，或?qū)⒖刂芁A的進展，改善臨床癥狀。
　　 嗅鞘細胞的生物學(xué)特性
　　

6、 嗅鞘細胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)作為一種具有星形膠質(zhì)細胞和雪旺細胞雙重特性的細胞，保留了許多發(fā)育階段的特性和可塑性，OECs的存在使嗅系統(tǒng)成為迄今發(fā)現(xiàn)唯一可以再生的中樞，它的生物學(xué)功能極其廣泛。對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、存活以及對突起生長有明顯的促進作用。Ramon-Cueto等研究表明嚙齒類動物的OECs能夠使脊髓損傷大鼠軸突再生并使再生的神經(jīng)纖維和脫髓鞘的神經(jīng)纖維復(fù)髓鞘，因而，OECs為細胞

7、移植治療CNS疾病開辟了一條希望之路。
　　 基于OECs的生物學(xué)作用，目前的許多研究都集中在應(yīng)用OECs移植來治療神經(jīng)組織的脫髓鞘損傷。通過對OECs與凋亡關(guān)系的研究，可以加強對OECs治療作用和機制的理解，擴展其治療范圍和改進其治療方法。
　　 建立OECs-VEGF基因工程細胞的構(gòu)想和意義
　　 隨著基因工程技術(shù)研究的不斷深入，基因治療成為腦血管疾病防治新的切入點，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使利用兩者治療LA成為可能，建

8、立基因工程細胞的構(gòu)想隨之產(chǎn)生。
　　 基于以上分析，設(shè)想：利用嗅球OECs進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮再生的VEGF目的基因轉(zhuǎn)入受體細胞，構(gòu)建高度表達VEGF的大鼠OECs-VEGF基因工程細胞株，將移植細胞注入腦內(nèi)，使其不但可以充分發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，并為解決VEGF表達量較少、持續(xù)性欠佳這一瓶頸問題提供了有效的解決途徑。從而為LA的細胞移植治療和基因治療探索出一種新的切實可行的具有突破性的方法。預(yù)期OECs在LA模型的腦內(nèi)大量傳代

9、擴增，向神經(jīng)系細胞分化，具有促進軸突再生和修復(fù)髓鞘的作用；同時，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的OECs生物活性更強，持續(xù)分泌更多的促進血管內(nèi)皮再生的VEGF，從而改善LA神經(jīng)組織的微循環(huán)，促進血管再生，減輕神經(jīng)組織的缺血性損傷。
　　 本研究旨在嗅球OECs的分離、培養(yǎng)、純化，攜帶human-VEGF165基因慢病毒的構(gòu)建、合成以及病毒對OECs的轉(zhuǎn)染，完成OECs-VEGF基因工程細胞的構(gòu)建。
　　 研究目的：
　　 1.探索將h

10、uman-VEGF165基因?qū)隣ECs的方法，分析構(gòu)建OECs-VEGF基因工程細胞的可行性。
　　 2.研究從大鼠嗅球分離培養(yǎng)純化OECs的方法與技巧。
　　 3.構(gòu)建攜帶human-VEGF165基因的慢病毒載體。
　　 4.human-VEGF165-LV轉(zhuǎn)染OECs，構(gòu)建OECs-VEGF165基因工程細胞。
　　 研究方法：
　　 1.嗅球OECs的取材、分離、培養(yǎng)、純化與鑒定。

11、>　　 將雄性SD大鼠斷頭處死后，取嗅球嗅神經(jīng)層和嗅球顆粒層剪碎，放在胰酶中，置培養(yǎng)箱內(nèi)消化。用含F(xiàn)BS的DF12終止消化，吹打，靜置，吸取上層懸液待接種，重復(fù)3次。OECs的純化方法主要為差速貼壁法。將細胞懸液接種，加入雙抗，培養(yǎng)。調(diào)整細胞，種植，貼壁。每3天換液一次。取原代細胞，制成細胞懸液。在24孔板中接種，測細胞總數(shù)，求平均值，持續(xù)計數(shù)9天，做出生長曲線。
　　 采用免疫熒光鑒定OECs原代細胞純度：吸去培養(yǎng)液，反復(fù)漂

12、洗、固定、孵育細胞兩次，滴加Hoechst33342復(fù)染核，滴加堿性甘油于載玻片上，p75染色，封固后熒光顯微鏡下觀察。計算高倍鏡下視野中核的數(shù)目以及陽性細胞數(shù)，并計算陽性細胞數(shù)與核數(shù)的比例，即為OECs的純度。
　　 2.構(gòu)建攜帶human-VEGF165基因的慢病毒載體。
　　 使用慢病毒包裝試劑盒，通過三種質(zhì)粒的共同轉(zhuǎn)染293T細胞，合成攜帶目的基因的慢病毒載體。
　　 1)克隆構(gòu)建：①過表達目的基因的載體

13、制備：利用PCR方法釣取目的基因，將目的載體進行酶切，交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞。②明確目的基因及載體信息。③DNA瓊脂糖凝膠電泳。④用CaCl2制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞。⑤轉(zhuǎn)化：將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)基上。長出的克隆進行后續(xù)PCR鑒定。
　　 2)質(zhì)粒表達檢測：①準備目的細胞。②目的細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書進行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染后觀察質(zhì)

14、粒上熒光標記基因的表達情況以判斷感染效率。③蛋白印跡法檢測目的基因表達，將收集的細胞提取蛋白進行蛋白印跡檢測，同時提取7860細胞，和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞分別作為空白對照和陰性對照。
　　 3)病毒包裝和收集濃縮：細胞狀態(tài)對于病毒包裝至關(guān)重要，因此需要保證良好的細胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。收集濃縮后，進行病毒生物學(xué)滴度測定。
　　 4)病毒滴度檢測：使用熒光實時定量PCR法測定病毒滴度，通過比較control組和實驗組

15、的Ct值差異判斷滴度值。
　　 3.human-VEGF165-LV轉(zhuǎn)染OECs、構(gòu)建OECs-VEGF165基因工程細胞。
　　 1)預(yù)實驗：分四組進行，每組四個不同梯度的MOI(Multiply of Infection)，共16孔，其中每種實驗條件做三個復(fù)孔。每組均有不同梯度的MOI值。
　　 2)免疫熒光檢測：將未轉(zhuǎn)染的OECs與轉(zhuǎn)染后OECs傳代接種，棄培養(yǎng)液，漂洗細胞兩次，室溫固定，PBS洗滌，加入正

16、常山羊血清后進行孵育，洗滌，再在爬片上滴加Hoechst33342復(fù)染核，堿性甘油封固后熒光顯微鏡下觀察。同時在染色過程中制作有陰性對照玻片，未加一抗。
　　 3)Real time-PCR：①總RNA提?。喝?孔板細胞，用吹打管吹至液體澄清，無細胞團塊轉(zhuǎn)至EP管中。用力搖晃試管、離心。用移液槍轉(zhuǎn)上層水相于另EP管中，加等體積異丙醇，沉淀RNA，離心，用紫外光度檢測RNA濃度。②RT-PCR：進行轉(zhuǎn)染后OECs與未轉(zhuǎn)染OECs細

17、胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄。RT試劑盒中試劑解凍后，搖晃試管使其均勻，再稍離心，放于冰盒上操作。③Real-time PCR，融解曲線分析。
　　 4)ELISA檢測：在標準品孔及待測樣本孔中分別加入酶聯(lián)親和物，包被微孔板覆膜、孵育后扣干孔內(nèi)剩余殘液，每孔依照次序分別加入底物，避光反應(yīng)后每孔分別加入終止液，終止反應(yīng)。使用酶標儀讀取OD值。Logit-Log直線回歸計算、繪制出標準曲線圖。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.嗅球

18、OECs的取材、分離、培養(yǎng)、純化與鑒定。
　　 1)差速貼壁法所取出的原代細胞約在所有細胞中占98％，但是隨著代數(shù)的增加，OECs的純度很快下降，在第二代約占78％，到第三代純度降至58％。
　　 2)細胞形態(tài)和生長特性：純化后OECs形態(tài)較為一致，主要呈梭性，約占細胞總數(shù)的90％以上；OECs也有其它形態(tài)，比較常見的有多突起型和不規(guī)則型。傳代后OECs的形態(tài)發(fā)生改變，增殖形成的緊密連接消失，細胞也從梭性變成多突起形狀。

19、在培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)充分且完全的情況下，活性差的細胞漸漸凋亡，脫離瓶底，但對于大多數(shù)的細胞則可從多突起形態(tài)轉(zhuǎn)化為增殖能力較強的梭形形態(tài)，繼續(xù)增殖。
　　 3)原代OECs的增殖能力強，但隨著傳代次數(shù)的增加，OECs純度下降，活性也明顯下降，并且細胞的形態(tài)變得多種多樣，增殖變緩。
　　 2.構(gòu)建攜帶human-VEGF165基因的慢病毒。
　　 1)質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建：從載有humanVEGF165基因的質(zhì)粒上擴增出目

20、的基因片段，并重新鏈接與用于慢病毒包裝載體的質(zhì)粒上，通過對連接上的陽性轉(zhuǎn)化子測序，并與NCBI上的目的基因序列進行比對，得出包裝質(zhì)粒上連接的目的基因序列正確。
　　 2)質(zhì)粒表達目的基因檢測：攜帶有EGFP蛋白基因做標記的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入293T細胞內(nèi)，24小時后細胞內(nèi)即可觀察到明顯的熒光，表明目的基因與EGFP表達正常。目的基因蛋白預(yù)測大小為22KD。通過Western Blot檢測，從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的293T細胞提取的蛋白

21、中可以檢測到22KD附近處有條帶，其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合。這表明連接于克隆載體質(zhì)粒上的目的基因在進入細胞后過表達成功。
　　 3)合成病毒的滴度：通過Real-time PCR來檢測病毒的滴度，得出在相當(dāng)于病毒原液萬分之一組(即梯度稀釋中的10-4ul組)和Con組樣品的Ct值出現(xiàn)2個循環(huán)左右差異，認為在10-4ul組樣品中存在病毒顆粒，得出病毒滴度為2×108個/ml。
　　 3.human-VEGF1

22、65-LV轉(zhuǎn)染OECs、構(gòu)建OECs-VEGF165基因工程細胞
　　 1)通過對不同濃度的病毒，以及不同轉(zhuǎn)染條件的比較，得出對OECs慢病毒基因載體的最佳感染條件如下：對于合成的慢病毒，在MOI為10時即得到大于80％的感染效率；相對于普通培養(yǎng)基，Eni.s培養(yǎng)基并不能明顯提高感染效率：Polybrene同樣對病毒的感染效率改變不大。
　　 2)轉(zhuǎn)染后，OECs的生長活性受到影響。12小時內(nèi)進入“休止期”，24小時后，

23、細胞培養(yǎng)上清內(nèi)死細胞增多，熒光不可見，48小時后，轉(zhuǎn)染組的細胞死亡的更多，72小時后，少量細胞可見微弱熒光表達，96小時后，大部分細胞內(nèi)出現(xiàn)EGFP的表達。
　　 3)轉(zhuǎn)染組MOI三個不同亞組，GFP陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例大于80％。但是在轉(zhuǎn)染后，10與20亞組細胞死亡較多，MOI為5亞組細胞死亡較少，細胞功能恢復(fù)快。對轉(zhuǎn)染成功的OECs進行VEGFA免疫熒光染色，可觀察外源VEGFA的表達。通過對轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染對OECs生

24、長的影響，初步確定大量轉(zhuǎn)染OECs時，MOI值為5是合適的選擇。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過差速貼壁法純化從嗅球提取出的OECs有高純度和較好的活性，是體外研究OECs時提取和純化原代細胞簡便、經(jīng)濟的方法，適合進行相關(guān)的進一步研究。
　　 2.隨著原代細胞傳代次數(shù)的增加，OECs的純度和活性都明顯下降，因而在OECs研究時，要選擇合適傳代次數(shù)下的OECs進行研究，使結(jié)果具有代表性。
　　 3.攜帶有hu