tPA-VEGF165雙基因靜電紡絲涂層機(jī)械瓣膜的構(gòu)建及體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：tPA-VEGF165真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：通過(guò)克隆從模板中獲得人組織型纖溶酶原激活因子（tPA）和人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子165（VEGF165）目的基因片段，然后將其分別插入真核表達(dá)載體pIRES 質(zhì)粒的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，以構(gòu)建攜帶目的基因的兩個(gè)載體質(zhì)粒pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165。
　　 材料和方法：按照人tPA基因的CDS 序列（NM_000930.3）和

2、人VEGF165基因的序列（NM_001025368）設(shè)計(jì)引物，引物分別包含內(nèi)切酶EcoR I和Xba I 酶切位點(diǎn)，以pcDNA3.1-Myc-His B(-)／tPA 質(zhì)粒和cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收DNA；分別用內(nèi)切酶EcoR I和Xba I將pIRES 質(zhì)粒線性化，然后把tPA和VEGF165目的基因片段重組入多克隆位點(diǎn)，并調(diào)換插入順序，分別獲得pIRES-VEGF165-tPA

3、和pIRES-tPA-VEGF165兩個(gè)質(zhì)粒；所構(gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選單克隆，菌落PCR檢測(cè)目的基因，然后將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送檢測(cè)序。
　　 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明PCR擴(kuò)增目的基因，獲得大小約為1721bp和1151bp的DNA，與人tPA和VEGF165基因序列相符合；菌落PCR表明pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞均可得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，而他們

4、的測(cè)序結(jié)果表明載體質(zhì)粒中所包含的基因序列與Pubmed中其對(duì)應(yīng)的CDS 序列相比，插入方向正確，tPA基因中的CTG（編碼Leu）同義突變?yōu)镃TA（編碼Leu），VEGF165基因中同樣也僅出現(xiàn)數(shù)個(gè)同義突變，均不會(huì)影響蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建出了攜帶人組織型纖溶酶原激活因子（tPA）和人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子165（VEGF165）目的基因片段的兩個(gè)載體質(zhì)粒pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF1

5、65。
　　 第二部分：tPA-VEGF165真核表達(dá)載體的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　 目的：通過(guò)體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒能否轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，并檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)錄，翻譯，以及蛋白分泌和功能方面的情況，同時(shí)比較pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)方面有無(wú)區(qū)別。
　　 材料和方法：轉(zhuǎn)染試

6、劑Attractene Transfection Reagent 介導(dǎo)pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926），同時(shí)，以表達(dá)綠色熒光蛋白的pGFP 質(zhì)粒與載體質(zhì)粒按照1：1的比例共轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，以綠色熒光蛋白作為示蹤標(biāo)志，計(jì)算轉(zhuǎn)染后12h，24h和48h 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，設(shè)置轉(zhuǎn)染空pIRES 質(zhì)粒和空白PBS 作為對(duì)照；
　　 熒光實(shí)時(shí)定

7、量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中tPA和VEGF165的mRNA 相對(duì)含量，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況；提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清，ELISA 檢測(cè)上清液中所含有的分泌蛋白tPA和VEGF165濃度，并用MTT 試驗(yàn)和tPA 活性檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)蛋白功能。
　　 結(jié)果：通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)染后綠色熒光下陽(yáng)性細(xì)胞的比率發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后約24h，陽(yáng)性細(xì)胞比率最高，隨后逐漸減少，pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VE

8、GF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率分別約為15.6±3.1％和16.3±2.9％，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細(xì)胞中VEGF165和tPA的mRNA相對(duì)含量及蛋白含量明顯高于轉(zhuǎn)染pIRES 空質(zhì)粒和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細(xì)胞中tPA基因的mRNA 相對(duì)含量和蛋白含

9、量高于轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而VEGF165基因方面兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ELISA，MTT 試驗(yàn)以及tPA 蛋白活性檢測(cè)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細(xì)胞上清中VEGF165和tPA的蛋白含量及功能明顯高于轉(zhuǎn)染pIRES 空質(zhì)粒和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒

10、組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：所構(gòu)建的pIRES-VEGF165-tPA和pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒能夠在體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，并指導(dǎo)合成、分泌有功能活性的tPA和VEGF165蛋白，盡管轉(zhuǎn)染pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)目的基因的mRNA和蛋白含量略高，但不能因此認(rèn)定它與pIRES-VEGF165-tPA 質(zhì)粒在功能上存在差異。
　　 第三部分：交聯(lián)明膠微球靜電紡絲涂層滌綸材料的制備及相關(guān)

11、理化性質(zhì)的研究
　　 目的：以交聯(lián)明膠微球作為緩釋載體，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)將其與滌綸材料有機(jī)結(jié)合，制備出能夠長(zhǎng)期釋放質(zhì)粒DNA的復(fù)合材料，并檢測(cè)該材料在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、細(xì)胞相容性、載藥率等理化性質(zhì)方面的特點(diǎn)，以期將該材料用于構(gòu)建新型機(jī)械瓣膜。
　　 材料和方法：將交聯(lián)明膠微球和10％聚乙烯醇（PVA）溶液按照不同的質(zhì)量容積比配制成電紡液，設(shè)置電壓，噴頭距離等參數(shù)進(jìn)行紡絲，滌綸補(bǔ)片置于接收裝置內(nèi)接受紡絲纖維，最終制得超細(xì)纖維涂層

12、的復(fù)合滌綸材料，掃描電鏡檢測(cè)表面形態(tài)；將涂層滌綸材料小塊置入蒸餾水中，與搖床上振搖檢測(cè)材料成分的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；MTT 試驗(yàn)檢測(cè)涂層滌綸材料對(duì)EA.hy926細(xì)胞增殖的影響；按照質(zhì)粒/涂層滌綸材料不同質(zhì)量比將兩者混合，通過(guò)測(cè)量結(jié)合后溶液中剩余質(zhì)粒的量來(lái)計(jì)算涂層滌綸材料載藥率，同時(shí)也測(cè)量單純滌綸材料以及單純的紡絲涂層材料的載藥率作為對(duì)比；最后將結(jié)合有質(zhì)粒的涂層滌綸材料置PBS 溶液中，37℃下以30rpm的速度持續(xù)振搖，間斷提取溶液樣本，以在

13、260nm 處的吸光度值作為相對(duì)含量，繪制材料緩釋質(zhì)粒的曲線。
　　 結(jié)果：交聯(lián)明膠微球和PVA 溶液的質(zhì)量容積比在1/100 之內(nèi)時(shí)，室溫下，電壓16-20kV，接收距離10-12cm，注射速度2-4ml/h 電紡可以獲得均一的超細(xì)纖維氈，交聯(lián)明膠微球散布與纖維之間，并隨著微球質(zhì)量的增加，分布密度也增加；在30-200rpm的速度振搖下涂層滌綸材料各部分結(jié)合緊密，結(jié)構(gòu)完整未見(jiàn)明顯脫落現(xiàn)象；MTT 試驗(yàn)證實(shí)涂層滌綸補(bǔ)片干預(yù)組細(xì)胞

14、與單純Dacron 補(bǔ)片干預(yù)組細(xì)胞，以及空白對(duì)照組細(xì)胞間增殖速度相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)質(zhì)粒與涂層滌綸材料質(zhì)量比在1：100 左右時(shí)，材料的載藥率達(dá)到最大值75％左右，隨后進(jìn)一步加大投入的質(zhì)粒量，并不能增加載藥率；根據(jù)緩釋曲線可見(jiàn)涂層滌綸材料可以在體外逐漸釋放質(zhì)粒，前2天釋放速度較快，從第8天開始減慢，第12天以后釋放的總的質(zhì)粒的量呈減少趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：攜帶質(zhì)粒的交聯(lián)明膠微球可以通過(guò)靜電紡絲技術(shù)同滌綸材料進(jìn)行結(jié)合，該復(fù)合材

15、料在流體剪切力的作用下可以保持結(jié)構(gòu)完整，它的相容性好對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，能夠攜帶質(zhì)粒DNA并且在體外逐步釋放，可以用于構(gòu)建新型機(jī)械瓣膜。
　　 第四部分：tPA-VEGF165雙基因交聯(lián)明膠微球靜電紡絲涂層滌綸材料的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　 目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)攜帶質(zhì)粒的交聯(lián)明膠微球靜電紡絲涂層滌綸材料對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以及是否能夠分泌相關(guān)目的蛋白。
　　 材料和方法：將攜帶質(zhì)量比為1：1的pIRES-tPA-VE

16、GF165質(zhì)粒和pGFP 質(zhì)粒的涂層滌綸材料浸入完全細(xì)胞培養(yǎng)基中，獲取其在不同時(shí)段的浸提液，然后加入微泡造影劑Sono Vue 輔以頻率1MHz，強(qiáng)度2 W/cm2的超聲照射60sec，介導(dǎo)對(duì)EA.hy926細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24h后通過(guò)計(jì)數(shù)綠色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；超聲微泡介導(dǎo)pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，并設(shè)置轉(zhuǎn)染空pIRES 質(zhì)粒和空白PBS 作為對(duì)照，24h后ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清中t

17、PA和VEGF165蛋白含量。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染pIRES-tPA-VEGF165/pGFP 質(zhì)粒組細(xì)胞在6天內(nèi)均有陽(yáng)性細(xì)胞，其中前兩天轉(zhuǎn)染效率較高，約20％，隨后有所下降，對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)；ELISA 結(jié)果提示轉(zhuǎn)染了pIRES-tPA-VEGF165質(zhì)粒的各組細(xì)胞上清每個(gè)時(shí)段均能檢出tPA和VEGF165蛋白，整體趨勢(shì)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率相似，而且其相對(duì)含量明顯高于同時(shí)段的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染pIRES 空質(zhì)粒和空白P