人神經(jīng)營養(yǎng)因子-3基因的亞克隆及其基因工程細胞模型的建立.pdf

1、該驗利用細胞培養(yǎng)技術(shù),體外分離、培養(yǎng)、擴增人骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs),鑒定其生物學(xué)特性;以脂質(zhì)體介導(dǎo)方法,將人神經(jīng)營養(yǎng)因子-3基因?qū)隑M-MSCs,構(gòu)建BM-MSCs基因工程細胞模型;PCR檢測NT3體外表達,并觀察其細胞培養(yǎng)上清液體外促進豚鼠耳蝸毛細胞的存活作用.方法:(1)細胞培養(yǎng):利用細胞培養(yǎng)技術(shù),體外分離、培養(yǎng)、擴增人骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs),光學(xué)顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài),生長特點.(2)BM-MSC表面標(biāo)

2、記的檢測:把將近融合的第3代BM-MSCs用0.25％胰酶消化,離心,PBS洗滌,制備成1×10<'6>/mL的細胞懸液,用流式細胞儀檢測其表面標(biāo)記.(3)四氮唑藍鹽法繪制生存曲線:第3、6、9代BM-MSCs制成單細胞懸液,用BiolRad酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔OD值(λ=570nm),繪制生長曲線.(4)pEGFP-N1轉(zhuǎn)染BM-MSCs:用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,以pEGFP-N1轉(zhuǎn)染第4代和第7代BM-MSCs,計數(shù)其轉(zhuǎn)染率.(5)真

3、核表達載體pcDNA3.1(+)/NT3的構(gòu)建:以HindⅢ、EcoRI雙酶切pUC18/NT3和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒,回收NT3和pcDNA3.1(+)大片段,用T4 DNA連接酶連接.(6)目的基因轉(zhuǎn)染BM-MSCs和穩(wěn)定克隆的篩選:以脂質(zhì)體介導(dǎo),用pcDNA3.1(+)/NT3和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BM-MSCs,37℃、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h.以含300 μ g/mlG418篩選三周,有克隆形成,再以含2

4、00 μ gG418/m1維持并擴大培養(yǎng).(7)離體孵育豚鼠耳蝸毛細胞:活殺豚鼠后取出兩側(cè)顳骨,將基底膜從蝸軸分離,置于Hanks培養(yǎng)液中.實驗組加Hanks液和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/NT3的BM-MSCs培養(yǎng)上清液,對照組加Hanks液和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的BM-MSCs培養(yǎng)上清液,37℃、5%CO<,2>條件下孵育4小時,觀察毛細胞生長情況.結(jié)論:(1)采用該驗培養(yǎng)細胞的方法體外分離、培養(yǎng)、擴增人BM-MSCs是可行的