人BDNF基因克隆及其基因工程細(xì)胞對(duì)體外小鼠螺旋神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的:神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)素4/5(NT4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)素-6(NT-6)等幾種.它們具有高度同源性.實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)因子家族中的BDNF對(duì)神經(jīng)元有支持存活、增進(jìn)代謝、有助分化和再生等作用.對(duì)于外周聽覺神經(jīng)系統(tǒng),BDNF、NT3、NGF等表達(dá)水平的改變與聽神經(jīng)末梢的發(fā)育、分

2、布有密切的關(guān)系,貫穿于從聽板形成至corti器毛細(xì)胞與傳入、傳出聽神經(jīng)末梢間建立突觸關(guān)系的全過程.該文的研究內(nèi)容是克隆BDNF基因并插入到pcDNA3.1(-)中,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞后檢測(cè)其表達(dá),轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)后檢測(cè)其上清對(duì)體外培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力的影響.方法:1.腦源性神經(jīng)生長因子BDNF基因克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建.首先抽提人胚腦總mRNA,以RT-PCR擴(kuò)增出BDNF基因片段并構(gòu)建測(cè)序載體,測(cè)序證實(shí)克隆基

3、因序列后將BDNF基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中,電泳證實(shí).2.BDNF基因工程細(xì)胞模型的建立及活性檢測(cè).首先將載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到無BDNF背景的COS7細(xì)胞中,以免疫組織化學(xué)檢測(cè)證明其可以表達(dá)出BDNF產(chǎn)物,再轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,取上清液加到螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基中,通過MTT檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞活力的影響.結(jié)果:該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-BDNF可以在COS7細(xì)胞中持續(xù)表達(dá),其產(chǎn)物可有效保