幾株基因工程鏈霉菌的構(gòu)建.pdf

1、鏈霉菌是重要的抗生素生產(chǎn)菌,其代謝過程的深入研究可以從基因水平解釋體內(nèi)代謝物變化,以及對(duì)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的影響,從而為工業(yè)生產(chǎn)菌株的分子水平優(yōu)化提供方向。
　　 乙酸是鏈霉菌無氧代謝的末端產(chǎn)物,乙酸累積抑制菌體生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)。乙酰-CoA是某些次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要前體,在理論上阻斷乙酰-CoA生成乙酸的途徑有可能促進(jìn)菌體生長(zhǎng),同時(shí)增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。敲除糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶磷酸果糖激酶主要合成基因來使碳代謝流從糖酵解途徑轉(zhuǎn)移

2、到磷酸戊糖途徑,可研究?jī)蓷l代謝途徑對(duì)葡萄糖代謝的影響,以及不同代謝途徑的中間產(chǎn)物對(duì)次級(jí)代謝物質(zhì)合成的作用,對(duì)初級(jí)代謝的進(jìn)一步研究有指導(dǎo)意義。透明顫菌血紅蛋白所具備的捕捉和釋放氧氣的能力使之在宿主細(xì)胞發(fā)酵時(shí)可以更好地滿足宿主細(xì)胞氧氣的需求。在鏈霉菌中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白,能夠改善鏈霉菌對(duì)高氧的需要,促進(jìn)體內(nèi)代謝,在理論上可能提高發(fā)酵過程中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　 本文利用RED敲除原理分兩步敲除鏈霉菌乙酸代謝途徑關(guān)鍵酶pta-ack

3、A基因和磷酸果糖激酶基因pfkA1。通過同源對(duì)比,擴(kuò)增出關(guān)鍵酶基因。通過PCR、酶切、連接將其克隆到cosmid載體上,構(gòu)建中間質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW25113／pIJ790體內(nèi),然后將安普抗性標(biāo)記片斷目標(biāo)基因置換,構(gòu)建出敲除載體。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方式,導(dǎo)入利迪鏈霉菌。并通過松弛培養(yǎng),篩選得到鏈霉菌pta-ackA缺失菌株AS01和pfkA1缺失菌株AS02。
　　 根據(jù)透明顫菌血紅蛋白基因vgb堿基序列和鏈霉菌基因密碼