Ca2+-Calpain-CDK5信號(hào)通路對(duì)耳毒性耳聾模型大鼠毛細(xì)胞死亡的調(diào)控作用.pdf

1、目的:探討CDK5/P35在耳蝸組織的空間表達(dá)情況,以及在耳毒性模型中是否通過(guò)激活周期素依賴(lài)性蛋白激酶5(Cyclin Dependent Kinase-5,CDK5)信號(hào)通路而引起耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞損傷,從而導(dǎo)致耳聾的發(fā)生,以期對(duì)該通路誘發(fā)的耳聾的干預(yù)。
　　方法:首先用免疫熒光組織化學(xué)法、WesternBlot、PCR的方法同時(shí)證實(shí)了在大鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞確實(shí)存在CDK5及其激活劑P35的表達(dá)。急性毛細(xì)胞體外給藥檢測(cè)硫酸卡那霉素是否造成

2、毛細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的上調(diào)而引起鈣超載。在此基礎(chǔ)上,利用體外培養(yǎng)的耳蝸毛細(xì)胞耳毒性損傷模型,以出生后4天乳大鼠耳蝸基底膜分離進(jìn)行體外培養(yǎng),收集蛋白,WesternBlot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞死亡的上游分子Calpain以及CDK5與P35的變化。體外培養(yǎng)耳蝸毛細(xì)胞隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組,硫酸卡那霉素處理組,硫酸卡那霉素加Roscovitine組,各組同時(shí)培養(yǎng)8h,后進(jìn)行PI染色,觀察細(xì)胞死亡的水平。
　　結(jié)果:1.在大鼠耳蝸毛細(xì)胞中,螺旋

3、器部分CDK5/P35的免疫熒光組織化學(xué)、Western Blot、PCR、體外激酶反應(yīng)結(jié)果均呈陽(yáng)性;
　　2.體外急性給予KM會(huì)導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的顯著提高,并呈時(shí)間依賴(lài)性;
　　3.體外培養(yǎng)耳蝸毛細(xì)胞經(jīng)耳毒性藥物硫酸卡那霉素處理后,Calpain表達(dá)量上升,CDK5表達(dá)量無(wú)明顯變化,P35表達(dá)量下降,P25表達(dá)量上升;給予CDK5抑制劑Roscovitine處理后,死亡的毛細(xì)胞數(shù)量較單純給與硫酸卡納處理組有所減少。<