抑制FGF信號通路對橢圓囊毛細胞再生的調控研究.pdf

1、目的：慶大霉素等氨基糖苷類藥物對內耳的毒性作用可通過破壞毛細胞而引起的聽力和平衡功能受損表現出來。但慶大霉素對橢圓囊感覺上皮的破壞程度和抑制FGF信號通路對過表達Atoh1/Math1基因引起毛細胞再生的調控作用仍有待詳細論述。本研究擬解決問題:1.利用統(tǒng)計學方法對慶大霉素處理小鼠橢圓囊不同時間段引起的微紋區(qū)和非微紋區(qū)毛細胞損傷程度和細胞增殖程度進行研究;2.抑制FGF信號通路對Ad-Math1誘導小鼠橢圓囊感覺上皮區(qū)域與非感覺上皮區(qū)域

2、內細胞增殖和毛細胞樣細胞產生的調控作用;3.Ad-Math1誘導產生的新生毛細胞樣細胞是否具有細胞平面極性及其調控機制研究。
　　方法：本研究使用慶大霉素建立體外培養(yǎng)橢圓囊毛細胞的損傷模型。于不同時間段觀察慶大霉素對橢圓囊微紋區(qū)和非微紋區(qū)內Phalloidin標記的毛細胞纖毛和毛細胞特異性抗體MyosinⅦa陽性細胞的破壞程度;以及通過增殖細胞EdU特異性染色觀察感覺上皮和非感覺上皮的細胞增殖情況。之后，利用激光共聚焦和SPSS軟

3、件從形態(tài)學和統(tǒng)計學角度驗證和分析慶大霉素對毛細胞的破壞和細胞增殖的作用。通過含有Atoh1/Math1基因的腺病毒載體(Ad-Math1)轉染小鼠體外培養(yǎng)橢圓囊組織以促進毛細胞樣細胞產生。對轉病毒后不同時間點標本進行固定和免疫組織化學染色，驗證過表達Atoh1/Math1基因對感覺上皮和非感覺上皮細胞增殖情況、新生毛細胞樣細胞產生數量和規(guī)律的影響。與此同時，FGF信號通路阻滯劑與加入Ad-Math1和/或慶大霉素的橢圓囊組織共培養(yǎng)，觀察

4、其對新生毛細胞樣細胞的調控作用。最后應用觀察細胞平面極性的抗體Spectrin、γ-tubulin對Ad-Math1轉染的橢圓囊標本進行免疫熒光染色，觀察新生毛細胞樣細胞的細胞平面極性規(guī)律。
　　結果：通過免疫熒光染色的形態(tài)學和SPSS的統(tǒng)計學方法研究表明，體外培養(yǎng)新生小鼠前庭橢圓囊在慶大霉素處理后最早出現毛細胞纖毛損傷，以微紋區(qū)較明顯;毛細胞特異性標記物MyosinⅦa陽性的細胞隨著時間的延長逐漸減少;標記毛細胞前體細胞的Sox

5、2陽性細胞在微紋區(qū)中隨著時間的延長逐漸增多。同時，橢圓囊感覺上皮區(qū)域在慶大霉素處理后增殖細胞較對照組明顯增多，但隨著用藥劑量的增加，增殖細胞逐漸減少。Ad-Math1和慶大霉素共同作用橢圓囊組織后，感覺上皮區(qū)域細胞增殖較單純加入慶大霉素或Ad-Math1組多，且主要位于微紋區(qū)。當同時加入FGF阻滯劑SU5402時，增殖細胞無明顯增多，但感覺區(qū)域與非感覺區(qū)域毛細胞特異性標記物MyosinⅦa陽性細胞，即新生毛細胞樣細胞較單純加入Ad-Ma

6、th1組增多。新生毛細胞樣細胞動纖毛從細胞表面中央逐漸移向一側，且標記毛細胞纖毛極性的特異性標記物Spectrin和γ-tubulin染色顯示感覺上皮區(qū)域新生的毛細胞樣細胞與原位存在的毛細胞平面極性方向一致，即纖毛延極性分界線相對排列。而非感覺上皮區(qū)域新生毛細胞樣細胞極性紊亂。
　　結論：慶大霉素處理體外培養(yǎng)小鼠橢圓囊可導致毛細胞的損傷，并伴有感覺上皮和非感覺上皮細胞增殖能力增強。當過量表達Atoh1/Math1基因可促使橢圓囊感