Am80調(diào)節(jié)apelin基因表達的分子機制研究.pdf

1、目的:
　　 apelin是近年發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，通過與它的特異性受體APJ相互作用而發(fā)揮重要的生理和病理功能。apelin和APJ均在心血管系統(tǒng)表達，包括血管內(nèi)皮細胞(endothelialcells，EC)和血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells，VSMC)。apelin可調(diào)節(jié)血管張力，引起血壓下降或阻力血管舒張。體外實驗證實，apelin引起血管舒張主要是通過作用于內(nèi)皮細胞上的APJ受體及促進一

2、氧化氮合酶合成NO來實現(xiàn)的。另有研究表明，apelin也可以直接作用于平滑肌細胞而引起血管收縮，apelin還可通過正性肌力作用提高心肌的收縮力。此外，在EC和VSMC中，apelin是一個強效的血管生成因子和細胞分裂原，apelin及其受體APJ在心血管正常發(fā)育中起到非常重要的作用。apelin-APJ系統(tǒng)異常與高血壓的發(fā)病及其并發(fā)癥心力衰竭密切相關(guān)。在EC、VSMC和心肌細胞中，缺氧和血管生成素Ⅰ可以誘導(dǎo)apelin表達。然而，在心

3、血管系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)apelin表達的分子機制目前仍知之甚少。
　　 Krüppel樣因子5(Krüppel-likefactor5，KLF5)是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，是血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)的靶基因及心血管重塑的重要調(diào)節(jié)者，KLF5在調(diào)節(jié)VSMC表型方面也扮演重要的角色。重要的是，KLF5可以與許多其他的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、維甲酸受體α(retinoicacidreceptorα,RARα)、

4、CREB(cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)結(jié)合蛋白(CBP)和PPAR-δ(peroxisomeproliferators-activatedreceptor-δ，PPAR-δ)相互作用，共同調(diào)節(jié)許多基因的表達。另外，血管損傷后KLF5在血管平滑肌細胞中表達上調(diào)，在心血管重構(gòu)過程中激活許多基因，如血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowthfactorA/B,PDGFA

5、/B)、早期生長反應(yīng)基因-1(earlygrowthresponsegene-1，Egr-1)、纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor-1，VEGF)受體等。另外，我們也發(fā)現(xiàn)，KLF5可與RARα和HDAC2(histonedeacetylase2，HDAC2)在基礎(chǔ)條件下形成復(fù)合體，結(jié)合在p2

6、1的啟動子上并抑制其表達，而Am80誘導(dǎo)可使KLF5脫乙酰基并且從p21啟動子上解離，失去其抑制作用并導(dǎo)致p21啟動子的激活。
　　 Am80是一種人工合成的維甲酸類似物，是RARα的激動劑，已經(jīng)在臨床上用于治療急性早幼粒細胞性白血病。RARα屬于核受體超家族成員，當與配體，如Am80或全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)結(jié)合后，可促進VSMC分化和抑制VSMC增殖。因為血管平滑肌細胞的生物學(xué)行為

7、是由轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)和一系列的心血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)控制，比如apelin和ATRA等，因此我們預(yù)測，促增殖轉(zhuǎn)錄因子，如KLF5和Sp1(transcriptionfactorstimulatingprotein-1，Sp1)和促分化轉(zhuǎn)錄因子如RARα，在調(diào)控apelin基因表達中存在著相互作用。
　　 本研究旨在闡明Am80調(diào)節(jié)apelin基因表達的分子機制。
　　 方法:
　　 細胞培養(yǎng)，腺病毒及質(zhì)粒載體的構(gòu)建，定點

8、突變，小干擾RNA轉(zhuǎn)染，RNA提取及定量RT-PCR分析，Western印跡分析，熒光素酶報告基因分析，染色質(zhì)免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull-down分析，GSTpull-down分析，免疫共沉淀分析，BrdU摻入分析，細胞遷移分析，鬼筆環(huán)肽細胞骨架染色，免疫組化染色等。
　　 結(jié)果:
　　 1、KLF5和Sp1介導(dǎo)Am80誘導(dǎo)的apelin基因表達
　　 KLF5和Sp1在多種細胞的增殖和分化中，都發(fā)揮著重要

9、的調(diào)控作用。Am80作為RARα的激動劑，可以抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化和增殖，但Am80抑制VSMC表達轉(zhuǎn)化和增殖與KLF5和Sp1之間的關(guān)系尚不清楚。在本部分研究中，我們觀察KLF5和Sp1在Am80誘導(dǎo)apelin表達中的作用。結(jié)果如下:
　　 1.1、Am80在VSMC中上調(diào)apelin基因mRNA和蛋白表達水平
　　 基因芯片分析結(jié)果表明，在Am80處理的VSMC組中，apelinmRNA表達水平比對照組升高7.4

10、8倍。為了驗證微陣列分析的結(jié)果，我們應(yīng)用RT-PCR、實時定量PCR及Western印跡分析方法進一步檢測apelin在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達情況。結(jié)果顯示，Am80可顯著誘導(dǎo)apelin基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，且呈時間(0、2、6、12、24h)和劑量（0、2、4、8、16μM）依賴性。
　　 1.2、KLF5通過與apelin啟動子上的TCE位點1結(jié)合來調(diào)節(jié)Am80誘導(dǎo)的apelin轉(zhuǎn)錄
　　 我們利用計算機程序發(fā)現(xiàn)，在ape

11、lin啟動子的-793/-1區(qū)域包含3個TCE（transforminggrowthfactor-βcontrolelement，TCE）位點。為了檢測這3個位點是否對KLF5和Am80應(yīng)答，我們構(gòu)建了5'-端連續(xù)缺失的apelin啟動子報告基因進行熒光素酶報告基因的分析。結(jié)果表明，過表達KLF5顯著提高apelin的啟動子活性，而Am80的誘導(dǎo)可以進一步提高apelin啟動子的活性。
　　 為了證實這3個TCE位點是否為Am8

12、0和KLF5誘導(dǎo)apelin表達所必需，我們突變這3個不同的TCE位點后再進行報告基因分析。熒光素酶活性測定結(jié)果表明，突變TCE位點2(-173到-523)和TCE位點3(-523到-793)不影響KLF5對apelin啟動子的激活，但突變TCE位點1(-173-1)完全阻斷了KLF5對apelin啟動子的激活作用。
　　 1.3、KLF5和Sp1共同調(diào)節(jié)apelin的表達
　　 為了進一步驗證KLF5在apelin表達

13、中的重要性，我們分別用腺病毒表達載體pAd-KLF5感染VSMC和應(yīng)用小干擾RNA(si-KLF5)轉(zhuǎn)染VSMC，以此來過表達和敲低KLF5在VSMC中的表達。結(jié)果顯示，過表達KLF5顯著增加apelin的表達，Am80處理后apelin的轉(zhuǎn)錄和翻譯進一步增加;相反，敲低KLF5抑制Am80對apelin表達的誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果說明，KLF5介導(dǎo)Am80誘導(dǎo)的apelin表達。
　　 此外，由于Sp/KLF家族成員能夠識別相同的

14、CACCC(TCE)或者GC盒元件，因此，我們試圖探索Sp1是否也能調(diào)節(jié)apelin的表達。為了驗證這一假說，我們分別應(yīng)用腺病毒表達載體pAd-Sp1感染VSMC和應(yīng)用小干擾RNA(si-Sp1)轉(zhuǎn)染VSMC，以此來過表達和敲低Sp1在VSMC中的表達。我們發(fā)現(xiàn)，過表達或敲低Sp1對apelin表達的影響與過表達和敲低KLF5的結(jié)果是一致的。
　　 1.4、KLF5和Sp1通過與apelin啟動子上的TCE位點1結(jié)合介導(dǎo)Am80

15、誘導(dǎo)的apelin表達
　　 為了驗證Sp1是否也像KLF5那樣能夠結(jié)合在TCE位點1上，我們進行染色質(zhì)免疫共沉淀分析。結(jié)果顯示，Am80促進Sp1和KLF5在TCE位點1上的結(jié)合;與染色質(zhì)免疫共沉淀實驗結(jié)果相一致，寡核苷酸pull-down實驗分析也證實KLF5和Sp1結(jié)合在TCE位點1上，TCE位點1突變，阻斷它們的結(jié)合。
　　 2、Am80通過促進RARα與KLF5和Sp1相互作用而誘導(dǎo)apelin表達
　　

16、 因為Am80通過其特異性受體RARα介導(dǎo)它的生理效應(yīng)，因此我們試圖探索Am80是否通過促進RARα與KLF5和Sp1相互作用來調(diào)節(jié)apelin表達。在本部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)KLF5和Sp1通過將RARα募集到apelin啟動子的TCE位點1上而協(xié)調(diào)激活apelin的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果如下:
　　 2.1、RARα與KLF5和Sp1協(xié)同激活apelin啟動子的活性
　　 為了探明RARα對apelin啟動子活性的影響，我們用a

17、pelin啟動子報告基因及KLF5、Sp1和RARα表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染VSMC后進行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，單純過表達KLF5或Sp1或同時過表達兩種或三種轉(zhuǎn)錄因子，均可增強apelin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，當同時表達3種轉(zhuǎn)錄因子并給予Am80刺激后，apelin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進一步增強。以上結(jié)果表明，RARα和KLF5及Sp1協(xié)同激活apelin基因轉(zhuǎn)錄。
　　 用apelin啟動子報告基因及不同轉(zhuǎn)錄因子的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染VSMC

18、后進行熒光素酶活性分析。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染等量的Sp1及不同量的KLF5表達質(zhì)粒后，隨著KLF5表達量的增加，Sp1對apelin啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用逐漸增強。同樣，共轉(zhuǎn)染等量的KLF5及不同量的Sp1表達質(zhì)粒，隨著Sp1表達量的增加，apelin啟動子的活性亦增強。這些結(jié)果表明，KLF5和Sp1協(xié)同激活apelin的轉(zhuǎn)錄。
　　 2.2、Am80促進RARα與KLF5-Sp1復(fù)合物結(jié)合
　　 因為RARα與KLF5和Sp

19、1協(xié)同激活apelin啟動子的活性，所以我們通過免疫共沉淀和GSTpull-down實驗檢測它們?nèi)咧g是否存在相互作用。結(jié)果顯示，在未給予Am80刺激的VSMC中，RARα與KLF5和Sp1可以在一定程度上結(jié)合，給予Am80刺激后，RARα與KLF5-Sp1復(fù)合物結(jié)合活性增強。
　　 2.3、Am80促進RARαt-KLF5-Sp1復(fù)合物結(jié)合在apelin啟動子的TCE位點1上
　　 由于KLF5、Sp1和RARα三者

20、之間形成復(fù)合物，我們探索Am80是否促進該復(fù)合物在apelin啟動子上的募集。連續(xù)ChIP實驗分析顯示，用KLF5抗體先沉淀VSMC的染色質(zhì)片段可以擴增得到含有TCE位點1的DNA片段，Am80處理使KLF5與DNA的結(jié)合顯著增加。然后，用Sp1或RARα抗體再次沉淀KLF5抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段，二次沉淀物中仍能擴增得到含apelin啟動子TCE位點1的DNA片段。以上結(jié)果表明，RARα、KLF5和Sp1在apelin啟動子的TCE

21、位點1上形成復(fù)合物，Am80刺激促進三者在apelin啟動子上的募集裝配。按相同的方法，我們首先用Sp1抗體沉淀VSMC染色質(zhì)片段，然后再用KLF5或RARα抗體沉淀Sp1抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段，二次沉淀物中也能擴增得到含有apelin啟動子的TCE-位點1的DNA片段，所得到的結(jié)果與以上結(jié)果相一致。
　　 為了進一步研究RARα在apelin啟動子上的募集是否依賴于KLF5-Sp1復(fù)合物在apelin啟動子TCE位點1的結(jié)合

22、，我們應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)分別敲低內(nèi)源性KLF5和Sp1后，應(yīng)用ChIP分析檢測RARα在apelin啟動子上的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，應(yīng)用si-RNA技術(shù)敲低內(nèi)源性KLF5和Sp1可顯著抑制RARα在apelin啟動子上的募集。
　　 另外，我們應(yīng)用si-RNA技術(shù)敲低內(nèi)源性RARα后進行ChIP分析的結(jié)果也表明，Am80刺激明顯促進KLF5和Sp1在apelin啟動子TCE位點1上的結(jié)合;應(yīng)用si-RARα下調(diào)內(nèi)源性RARα表達

23、可減少Am80誘導(dǎo)的KLF5和Sp1在apelin啟動子上的募集。以上結(jié)果表明，RAR僅結(jié)合在KLF5-Sp1復(fù)合物上，以RARE非依賴的方式調(diào)節(jié)apelin基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 3、apelin促進VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖
　　 已經(jīng)證明VSMC的增殖和遷移受到許多因素的調(diào)控，但apelin對VSMC表型的調(diào)節(jié)仍然知道的很少。因此，在本部分研究中，我們探索apelin和Am80在調(diào)節(jié)VSMC表型中的關(guān)系。
　　 3

24、.1、apelin-13促進VSMC的增殖和遷移
　　 BrdU摻入分析實驗結(jié)果顯示，apelin-13以濃度(0、0.02、0.05、0.1、1μM)和時間(0、2、6、12、24h)依賴的方式促進VSMC的增殖。通過傷口愈合實驗分析，我們觀察apelin-13對VSMC平面遷移能力的影響。結(jié)果顯示，apelin-13可顯著增強VSMC的遷移能力;western印跡結(jié)果顯示，與遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrixme

25、talloproteinase-2，MMP-2）表達也明顯升高。
　　 同時，我們通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，apelin-13可以以濃度(0、0.02、0.05、0.1、1μM)和時間(0、2、6、12、24h)依賴的方式促進增殖標志基因PCNA和cyclinD1表達;而分化標志基因SMα-actin的表達明顯減少。鬼筆環(huán)肽染色顯示，apelin-13處理的VSMC中肌絲明顯減少;Am80處理明顯使VSMC形態(tài)伸長，形成許多粗大的、

26、沿細胞長軸平行排列的應(yīng)力纖維。這些結(jié)果提示，apelin-13促進VSMC向增殖表型轉(zhuǎn)化。
　　 3.2、apelin拮抗Am80誘導(dǎo)的VSMC分化
　　 為進一步研究apelin對VSMC表型的影響，我們應(yīng)用si-RNA技術(shù)敲低內(nèi)源性apelin后再用Am80處理細胞。免疫印跡實驗結(jié)果顯示，敲低內(nèi)源性apelin后再用Am80處理的VSMC與未敲低apelin直接用Am80處理的細胞相比，SM22α的表達升高而PCNA

27、的表達水平降低。同時，鬼筆環(huán)肽染色顯示，敲低內(nèi)源性apelin后再用Am80處理的VSMC伸長更加明顯，并形成更多的沿細胞長軸平行排列的應(yīng)力纖維。結(jié)果提示，apelin可以在一定程度上拮抗Am80誘導(dǎo)的VSMC分化。
　　 3.3、敲低apelin抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜的增生
　　 利用大鼠頸總動脈球囊損傷模型，我們觀察敲低apelin后對血管新生內(nèi)膜形成的影響。HE染色結(jié)果顯示，損傷14天后，與模型組相比，ap

28、elin敲低動物的血管內(nèi)膜/中膜(I/M)比值明顯降低。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，apelin敲低動物的血管新生內(nèi)膜和中膜中PCNA的表達明顯減少。結(jié)果表明，apelin可促進血管新生內(nèi)膜的形成。
　　 結(jié)論:
　　 1、Am80上調(diào)apelin基因mRNA和蛋白表達水平。
　　 2、KLF5和Sp1與apelin啟動子上的TCE位點1結(jié)合來調(diào)節(jié)Am80誘導(dǎo)的apelin轉(zhuǎn)錄。
　　 3、Am80通過促進