VSX1抑制flh基因表達的分子機制.pdf

1、原腸發(fā)生運動是構(gòu)建胚胎形體模式的關(guān)鍵事件，其運動模式和調(diào)控機制是生命科學探索了近百年的重大基礎(chǔ)科學問題。Paraxial protocadherin(papc)是一個細胞粘連分子，為跨膜蛋白，近來研究報道papc與Wnt/PCP途徑有關(guān)，控制著原腸形態(tài)發(fā)生過程中的集中延伸運動。一方面它的胞外結(jié)構(gòu)能與細胞粘連，另一方面它能將接收到的信號轉(zhuǎn)換為實際的細胞運動。papc在斑馬魚胚胎下包50％時，在胚環(huán)的側(cè)面和腹面中胚層區(qū)域表達。近來研究發(fā)現(xiàn)同

2、源異型基因flh在原腸期斑馬魚胚胎的脊索中胚層中表達而直接抑制spt在該處的轉(zhuǎn)錄；而spt在軸旁中胚層表達并激活papc在軸旁中胚層的表達。因此flh和spt共同調(diào)控papc表達的空間模式而在原腸形態(tài)運動過程中起著重要的調(diào)控作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)抑制斑馬魚中另一個同源異型基因vsxl基因的表達會導致原腸形態(tài)發(fā)生運動受阻和flh在側(cè)、腹中胚層區(qū)域的異位表達，以及spt和papc在這些中胚層區(qū)域的表達被抑制；而vsxl過表達時，flh基因

3、在脊索中胚層中的表達受到抑制。這些觀察結(jié)果提示vsxl能夠抑制flh基因在胚胎發(fā)育早期的異位表達。為進一步探究vsxl在原腸形態(tài)發(fā)生運動中的調(diào)控作用，本實驗進行了vsxl調(diào)控flh表達機制的深入分析。主要的結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 一、通過用vsxl mRNA分別與不同長度flh啟動子序列所控制的GFP報告基因共注射，檢測其對GFP報告基因表達的影響，證明了vsxl能有效抑制flh啟動子所控制的報告基因的表達，并確定了在flh啟動

4、子上的-204bp與-156bp之間可能含有vsxl或者vsxl下游基因作用的關(guān)鍵位點。
　　 二、根據(jù)含有同源異型域的蛋白與DNA結(jié)合的潛在結(jié)合位點為TAAT(NN)，對fth啟動子上的-204bp與-156bp之間的49bp的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)有1個TAATTG位點。將TAATTG位點突變成TCGATG后構(gòu)建了突變的報告基因MPZF-220GFP，再與vsxl mRNA共注射，則所控制的報告基因的表達不再受到抑制。這一結(jié)果說

5、明vsxl可能通過結(jié)合到flh基因啟動子的TAATTG序列上直接抑制flh的轉(zhuǎn)錄，而不是通過vsxl下游基因編碼的蛋白來間接抑制flh的轉(zhuǎn)錄。
　　 三、為了進一步證明flh啟動子上的TAATTG序列是VSX1直接作用的位點，我們用pGEX原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌中表達了包含VSX1同源異型域的重組蛋白GST+VSX1 HD，和在所確定的49bp的flh啟動子范圍內(nèi)，針對TAATTG位點，設(shè)計并合成了生物素標記的包含該位點的探針，

6、不標記生物素的探針和將TAATTG位點突變?yōu)門CCCCG的突變探針；采用凝膠阻滯方法檢測了VSX1蛋白在體外與flh啟動子TAATTG序列的結(jié)合。凝膠阻滯分析結(jié)果為：結(jié)合探針和GST+VSX1 HD多肽反應后，在非變性凝膠中看到了在自由探針條帶之后的滯后條帶；而在預先加入的500倍于標記探針的非標記探針進行競爭時，則檢測不到標記的滯后條帶，而預先加入500倍于標記探針的非標記突變探針進行競爭時，仍可以檢測到滯后條帶。這些體外實驗的結(jié)果證

7、明VSX1的確能與flh啟動子上的TAATTG序列直接結(jié)合。
　　 四、為了檢測在正常發(fā)育的胚胎細胞中VSX1是否與flh的啟動子直接結(jié)合以及結(jié)合位點的數(shù)目和位置，我們制備了多克隆抗體，并以其進行了染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)分析。對flh啟動子在1.9kb范圍內(nèi)13個包含TAATTN序列的位點的進行分析的結(jié)果表明，VSX1只與在-204bp與-156bp區(qū)域內(nèi)包含TAATTG序列特異結(jié)合，與其他的位點沒有結(jié)合。體內(nèi)ChIP分析