Apelin基因的表達(dá)規(guī)律及其在脂肪代謝中的調(diào)控作用.pdf

1、對(duì)脂肪組織的研究，不僅有助于動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量的提高，還可以為肥胖、糖尿病、高血壓等多種疾病提供一定的理論依據(jù)，為該類藥物的開發(fā)提供新思路。脂肪組織不僅可以儲(chǔ)存能量，而且可以分泌Apelin、瘦素（Leptin）、抵抗素(Resistin)等脂肪因子。它們通過(guò)自分泌、旁分泌的方式調(diào)控脂肪代謝和脂肪細(xì)胞的分化，參與肥胖及相關(guān)疾病的病理過(guò)程，因此對(duì)這些脂肪因子的研究顯得尤為重要。Apelin在2005年被確定為脂肪因子，它是G蛋白偶聯(lián)的受體血管緊

2、張素Ⅱ受體樣蛋白-J（APJ）的天然配體，在鼠類和人類的皮下脂肪組織中發(fā)現(xiàn)了Apelin的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Apelin可增加整體能量的消耗，提高胰島素的敏感性從而抑制胰島素抵抗的發(fā)生，與肥胖引起的多種疾病有重要關(guān)聯(lián)。雖然目前Apelin基因已經(jīng)在一些動(dòng)物中被克隆，但在豬這種重要的模式生物中尚未見該基因克隆及功能驗(yàn)證的報(bào)道。小檗堿（Berberine）又名黃連素，研究表明小檗堿通過(guò)AMPK信號(hào)通路改善小鼠糖脂代謝狀況

3、，從而降低肥胖小鼠體重。PPARγ和C/EBPα是成熟脂肪細(xì)胞形成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，小檗堿可以降低這些關(guān)鍵基因的表達(dá)量，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化[1,2]。但目前關(guān)于小檗堿對(duì)Apelin基因表達(dá)的影響未見報(bào)道。
　　本試驗(yàn)首先以豬的脂肪組織為研究材料，克隆Apelin基因片段；運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)探究Apelin基因在豬的7個(gè)不同組織間的表達(dá)規(guī)律，同時(shí)比較物種間Apelin基因的表達(dá)變化，研究種屬間的表達(dá)差異；使用不同濃度的小

4、檗堿處理健康SD大白鼠，取其皮下和腎臟周圍的脂肪組織，采用反轉(zhuǎn)錄PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)小檗堿對(duì)Apelin、PPARγ、LPL、LXRα等基因表達(dá)的影響，探討小檗堿在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮降脂的分子作用機(jī)制；最后對(duì)Apelin基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并建立生物進(jìn)化樹對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步研究Apelin基因的生物學(xué)功能，并為小檗堿在體脂沉積方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究結(jié)果如下：
　　1、豬Apelin基因的克隆。以豬的脂

5、肪組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR等技術(shù)克隆出豬的Apelin基因片段，片段長(zhǎng)度為267bp。獲得的Apelin基因序列為探究豬的組織差異表達(dá)等研究提供了基因材料和理論依據(jù)。
　　2、Apelin基因組織表達(dá)差異研究。以β-actin為參照基因，豬和SD大鼠的7個(gè)不同組織為材料，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)研究Apelin基因在各組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究Apelin基因的生物學(xué)功能。結(jié)果表明：Apelin基因

6、在物種各組織間表達(dá)量不均衡，且在脂肪組織中的表達(dá)量最高。不同物種間Apelin基因的組織表達(dá)差異比較發(fā)現(xiàn)，SD大鼠和豬的表達(dá)規(guī)律有一定的差異，但在脂肪組織中Apelin基因的表達(dá)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它組織中Apelin基因的表達(dá)量，暗示Apelin基因在脂肪代謝過(guò)程中有關(guān)鍵作用。
　　3、小檗堿對(duì)Apelin基因及其它脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的研究。為進(jìn)一步探究小檗堿在發(fā)揮降脂作用時(shí)，Apelin基因表達(dá)的變化及其在脂肪代謝中的作用，本試驗(yàn)

7、使用不同濃度的小檗堿對(duì)SD大鼠進(jìn)行活體灌胃處理，分別取其脂肪組織，與對(duì)照組相比。結(jié)果顯示：LPL、LXRα基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，相反Apelin基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)；PPARγ基因在m RNA表達(dá)受到抑制的同時(shí)其蛋白表達(dá)量也明顯下降，暗示小檗堿可以降低脂肪細(xì)胞的分化，同時(shí)也表明Apelin基因具有抑制脂肪生成的作用。
　　4、Apelin基因的生物信息學(xué)分析及親緣關(guān)系研究。生物信息學(xué)是計(jì)算機(jī)知識(shí)和生物學(xué)知識(shí)相結(jié)合的現(xiàn)代熱門學(xué)科，可

8、以對(duì)生物的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合分析，進(jìn)而推測(cè)其生物學(xué)功能及意義。本試驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)了解Apelin基因的高級(jí)結(jié)構(gòu)，得到大鼠的Apelin蛋白是一種跨膜蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲較多，可以形成二硫鍵。對(duì)Apelin蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析得出其含有1個(gè)低組分復(fù)雜性區(qū)域和1個(gè)跨膜區(qū)，且人與大鼠的Apelin蛋白結(jié)構(gòu)功能域極其相似。進(jìn)行人與大鼠的Apelin基因序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)鼠與的Apelin基因的同源性高，有比較近的親緣關(guān)系。