維甲酸受體激動(dòng)劑AM80誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化形成的中性粒細(xì)胞的殺胞的殺菌功能及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:中性粒細(xì)胞減少癥是由于外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量減少而出現(xiàn)的一組綜合征，是腫瘤治療中最常見(jiàn)的并具有潛在的致命性的并發(fā)癥。統(tǒng)計(jì)表明中性粒細(xì)胞減少癥在接受化療的實(shí)體腫瘤病人中發(fā)生率為10％-20％，院內(nèi)的死亡率達(dá)到9.8％。盡管重組粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)通過(guò)促進(jìn)人造血干細(xì)胞的粒系分化而發(fā)揮較好的的預(yù)防中性粒細(xì)胞減少癥的作用，但是其治療作用并不明顯。因此，尋找高效的誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化為中性粒細(xì)胞的藥物是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵。維甲酸

2、（RA）通過(guò)激活配體依賴(lài)性的轉(zhuǎn)錄激活因子RARα，促進(jìn)白血病的原始粒細(xì)胞和造血干細(xì)胞的粒性分化。維甲酸類(lèi)似物AM80是特異性的RARα受體激動(dòng)劑，研究表明AM80的誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化能力大約是RA的10倍并且毒性較低。2005年AM80在日本上市用于復(fù)發(fā)性難治性的急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療，但是AM80對(duì)造血干細(xì)胞分化的作用則未見(jiàn)報(bào)道。本文首先考察比較了AM80和G-CSF誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化的能力，其次比較AM80和G-CSF

3、誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化生成中性粒細(xì)胞的殺菌功能，最后對(duì)殺菌機(jī)制進(jìn)行研究。本研究對(duì)于將AM80作為一種成本較低的治療藥物運(yùn)用于中性粒細(xì)胞減少癥具有重要的指導(dǎo)意義。
　　方法和結(jié)果:我們首先考察了AM80，G-CSF以及其他的維甲酸受體激動(dòng)劑對(duì)造血干細(xì)胞CD34+細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。應(yīng)用吉姆薩染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示AM80誘導(dǎo)產(chǎn)生的成熟粒細(xì)胞的比例明顯高于G-CSF，表明AM80誘導(dǎo)造血干細(xì)胞CD34+細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于G-CS

4、F。臺(tái)盼藍(lán)拒染法和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示與G-CSF類(lèi)似，AM80(2.5 nM)在促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖的同時(shí)細(xì)胞的死亡率低于10％。我們進(jìn)一步采用透射電鏡觀(guān)察G-CSF誘導(dǎo)生成的粒細(xì)胞(GIN)，AM80誘導(dǎo)生成的粒細(xì)胞(AIN)以及外周血中性粒細(xì)胞(PBN)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，圖片顯示AIN中的顆粒蛋白數(shù)量多于GIN。我們隨后檢測(cè)大腸桿菌(E.coli DH5α)刺激下GIN，AIN和PBN脫顆粒的能力。Western blotting結(jié)果

5、顯示細(xì)菌刺激下AIN產(chǎn)生并分泌的顆粒蛋白髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，乳鐵蛋白(lactoferrin)，人類(lèi)內(nèi)源性抗菌肽(LL-37)，明膠酶(MMP-9)的水平均高于GIN。以上結(jié)果顯示AM80促進(jìn)粒細(xì)胞分化和粒細(xì)胞顆粒蛋白產(chǎn)生的能力強(qiáng)于G-CSF，提示AM80誘導(dǎo)產(chǎn)生的高水平分化可能轉(zhuǎn)化為對(duì)抗細(xì)菌感染的免疫功能。為了證明這一假設(shè)，我們采用吞噬和殺傷細(xì)菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)GIN，AIN和PBN殺傷大腸桿菌和金黃色葡萄

6、球菌能力，結(jié)果顯示細(xì)胞與細(xì)菌共孵育一定時(shí)間后，AIN和PBN細(xì)胞外細(xì)菌數(shù)顯著低于GIN，細(xì)胞內(nèi)存活細(xì)菌數(shù)同樣低于GIN。基于以上數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)和殺死細(xì)菌的數(shù)量，結(jié)果顯示AIN吞噬和殺傷細(xì)菌的數(shù)量明顯高于GIN。同時(shí)我們采用LIVE/DEAD BacLight細(xì)菌活性測(cè)定試劑盒結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存活狀態(tài)，結(jié)果表明GIN中的活菌數(shù)遠(yuǎn)多于AIN和PBN，AIN和PBN中殺死的細(xì)菌數(shù)遠(yuǎn)多于GIN。透射電鏡觀(guān)察細(xì)菌感染的

7、細(xì)胞同樣也顯示GIN中存在大量存活的細(xì)菌，而AIN和PBN中則沒(méi)有。以上結(jié)果均證實(shí)了AIN吞噬和殺傷細(xì)菌的能力強(qiáng)于GIN。為了深入研究AM80增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的殺傷細(xì)菌功能的機(jī)制，我們采用流式細(xì)胞術(shù)考察GIN，AIN和PBN表面抗原CD18-CD66，CD11 b-CD66的共表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果表明AIN細(xì)胞免疫抗原CD66a+CD18+和CD66b+CD18+的比例分別為40％和60％，而GIN細(xì)胞CD66a+CD18+和CD66b+C

8、D18+的比例則分別為13％和34.9％。同樣的，AIN細(xì)胞CD66a+CD11b+和CD66b+CD11b+的比例為40.9％和40％，GIN細(xì)胞則分別為20.2％和18％。以上數(shù)據(jù)結(jié)果顯示AIN細(xì)胞表面CD18-CD66和CD11b-CD66的表達(dá)水平高于GIN。這一結(jié)果提示AM80在促進(jìn)造血干細(xì)胞分化的同時(shí)也促進(jìn)了CD18-CD66信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的完善從而殺傷細(xì)菌。為了證實(shí)這一想法，我們采用CD18抗體中和CD18功能阻斷CD66-CD

9、18信號(hào)通路檢測(cè)GIN，AIN和PBN的殺傷大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性，結(jié)果顯示加入CD18抗體后，AIN和PBN吞噬和殺傷細(xì)菌的能力顯著下降。提示CD18-CD66信號(hào)通路在AM80誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞免疫功能的增強(qiáng)中發(fā)揮的重要作用。我們進(jìn)一步采用中性粒細(xì)胞減少癥小鼠模型考察G-CSF和AM80在體內(nèi)誘導(dǎo)分化的中性粒細(xì)胞的殺菌能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示盡管G-CSF能夠促進(jìn)外周血中性粒細(xì)胞的大量產(chǎn)生，但是AM80在小鼠中動(dòng)員的中性粒細(xì)胞吞噬和

10、殺傷細(xì)菌的能力強(qiáng)G-CSF。
　　結(jié)論:本論文首次研究了AM80誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化的中性粒細(xì)胞的殺菌功能并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。AM80誘導(dǎo)粒細(xì)胞分化能力強(qiáng)于G-CSF，AIN在體外和中性粒細(xì)胞減少癥小鼠模型中殺菌活性與PBN或者M(jìn)PBN類(lèi)似并強(qiáng)于GIN，可能是由于CD66和CD18相互協(xié)同作用加強(qiáng)了中性粒細(xì)胞的免疫功能。這一研究將為AM80作為一種低成本的治療方法用于誘導(dǎo)造血干細(xì)胞粒性分化進(jìn)而治療中性粒細(xì)胞減少癥提供了實(shí)驗(yàn)依