人新基因TMEM98在炎癥中作用的研究.pdf

1、2008年，國(guó)家人類基因組北方研究中心對(duì)人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選新的潛在細(xì)胞因子編碼基因，并進(jìn)行功能篩選和系統(tǒng)研究，獲得若干候選基因，TMEM98（transmembrane protein98）是其中之一。迄今對(duì)TMEM家族成員功能知之甚少，作用機(jī)制更是鮮有報(bào)道。
　　人TMEM98是沒有任何功能性文章報(bào)道的新基因，序列已知功能未知，其在多種組織包括免疫系統(tǒng)如脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓等廣泛表達(dá)，推測(cè)TMEM-98

2、可能作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子在免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。另外，TMEM98在受到多種炎性因子刺激后表達(dá)上調(diào)，表明其可能與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此，深入研究TMEM98蛋白，為其將來(lái)在炎癥治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　目的:
　　通過(guò)急性炎癥小鼠模型的建立及體外炎癥相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)，探索新基因TMEM98在炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制，初步探討將來(lái)在炎癥治療中應(yīng)用的可行性。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)菌培養(yǎng)

3、:肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae，Kp) LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)取單菌落至液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7～11h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期離心收集細(xì)菌，生理鹽水重懸，分光光度計(jì)（波長(zhǎng)620nm）測(cè)定OD值，調(diào)整濃度至107cfu/ml(OD=0.7)。動(dòng)物分組:雌性6～8周齡C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為正常組(Normal)6只、模型組(S aline+Kp)組12只、實(shí)驗(yàn)組(TMEM98+Kp)12只。實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射T

4、MEM98蛋白（100ng/只），模型組和正常組小鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。1h后戊巴比妥鈉(50μg/kg)腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，頸部無(wú)菌手術(shù)，模型組和實(shí)驗(yàn)組氣管內(nèi)注射20μl的Kp懸濁液，正常組給予20μl的生理鹽水。標(biāo)本采集和檢測(cè):注射Kp后24h處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離肺組織，HE染色觀察各組小鼠急性肺炎整體情況;肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè)分析各組小鼠肺部中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)及活性;RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺部炎性細(xì)胞因子（IL

5、-6，IL-8，TNF-α）mRNA的表達(dá);Western Blotting檢測(cè)各組小鼠肺部轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞培養(yǎng)、分組和處理:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)和人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，腫瘤壞死因子(Tumornecrosis factor, TNF)-α和細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharid

6、e，LPS）刺激培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(PBS)、蛋白(TMEM98)處理組、陽(yáng)性刺激組(TNF-α/LPS)、刺激物+蛋白組(TNF-α/LPS+TMEM98)。
　　檢測(cè)方法:MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMEM98蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖和毒性的影響;Real-time qPCR檢測(cè)TMEM98蛋白對(duì)HUVECs和THP-1兩細(xì)胞系炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、CXCL-2、MCP-1)的mRNA水平的影響;Western b

7、lotting檢測(cè)TMEM98蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子MAPK8、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(P65)的蛋白水平影響。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　小鼠肺組織常規(guī)HE染色:模型組肺泡間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，典型急性肺炎表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和少量炎性滲出。提示TMEM98蛋白對(duì)急性肺炎有減輕或抑制作用。肺組織勻漿MPO活性檢測(cè):模型組MPO活性顯著高于正常組(P

8、＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組MPO活性顯著低于模型組(P＜0.05)。MPO的活性間接反映局部中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度，提示TMEM98蛋白能顯著抑制中性粒細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，減輕炎癥損傷。RT-PCR檢測(cè)肺組織炎性因子:與正常組相比，細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平在模型組顯著高于正常組(P＜0.05)，在實(shí)驗(yàn)組顯著低于模型組(P＜0.05)。提示TMEM98蛋白能夠顯著降低肺組織炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的mR

9、NA水平，抑制急性肺炎。肺組織蛋白的Western Blotting檢測(cè):與正常組相比，模型組NF-κB蛋白水平顯著升高(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組NF-κB蛋白水平相比于模型組(Saline+Kp)顯著降低(P＜0.05)。提示TMEM98蛋白對(duì)急性肺炎的抑制作用可能與其降低NF-κB蛋白的水平有關(guān)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　MTT法檢測(cè)TMEM98蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞的增殖和毒性:增殖方面，TNF組的OD值高于PBS組(

10、P＜0.05)，TNF+TMEM98組OD值顯著低于TNF組(P＜0.05)。細(xì)胞毒性方面各組沒有表現(xiàn)出顯著差異。提示TMEM98蛋白對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，對(duì)HUVECs的細(xì)胞毒性和凋亡沒有顯著影響(P＞0.05)。Real-time qPCR檢測(cè)HUVECs及THP-1細(xì)胞炎性因子mRNA水平:HUVECs細(xì)胞:TNF組與PBS組相比，炎性因子IL-6、CXCL-2、MCP-1的mRNA水平顯著升高(

11、P＜0.05)，TNF+TMEM98組IL-6、CXCL-2的mRNA水平顯著低于TNF組(P＜0.05)。MCP-1的mRNA水平在TMEM98組顯著高于PBS組(P＜0.05)，在TNF+TMEM98組顯著高于TNF組(P＜0.05)。THP-1細(xì)胞:LPS組IL-8、CXCL-2的mRNA水平顯著高于PBS組(P＜0.05)，LPS+TMEM98組IL-8、CXCL-2的mRNA水平顯著低于LPS組(P＜0.05)。提示TMEM9

12、8能夠顯著抑制HUVECs或THP-1細(xì)胞在TNF-α或LPS刺激基礎(chǔ)上炎性細(xì)胞因子的分泌(MCP-1除外)。Western blotting方法檢測(cè)TMEM98蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞蛋白的表達(dá)情況:TMEM98組與PBS組相比HUVECs細(xì)胞NF-κB、MAPK8表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)，TNF+TMEM98組與TNF組相比HUVECs細(xì)胞NF-κB、MAPK8表達(dá)量也顯著下降(P＜0.05)，說(shuō)明TNF-α能夠上調(diào)HUVECs

13、細(xì)胞對(duì)VCAM-1、NF-κB、MAPK8蛋白的表達(dá)，但這種作用能夠被TMEM98蛋白抑制，推測(cè)TMEM98蛋白對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)炎性細(xì)胞因子、炎性蛋白表達(dá)的抑制作用與其對(duì)NF-κB、MAPK8兩條通路的作用密切相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.TMEM98生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其為非經(jīng)典途徑的分泌型蛋白。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)多種細(xì)胞因子以及參與局部組織細(xì)胞損傷的活性物質(zhì)，確定了TMEM98能夠明顯抑制Kp造成的急性肺炎，其中對(duì)NF