膠原蛋白肽生物功能材料的研究與開(kāi)發(fā).pdf_第1頁(yè)
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1、近年來(lái)隨著生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)的突破性研究發(fā)展,發(fā)現(xiàn)了膠原蛋白肽在人體內(nèi)有重要作用,其中,最具里程碑意義的是發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽有著自己的特征和性能。本論文將復(fù)合酶降解的膠原蛋白肽為研究方向,試圖建立一套系統(tǒng)的研究方案:對(duì)膠原蛋白肽的復(fù)合酶提取工藝、分離純化、檢測(cè)技術(shù)以及相關(guān)理論進(jìn)行探討:并對(duì)氨基酸序列和三維立體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及膠原蛋白肽的一些功能和性質(zhì)進(jìn)行分析和研究;同時(shí),對(duì)金屬肽的合成和膠原蛋白肽的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索。 用復(fù)合酶去酶解皮

2、革下腳料鉻革屑,利用酸性蛋白酶3350、堿性蛋白酶2709、中性蛋白酶AS1.398、Protamex、Flavourzyme等水解皮革,提取其中的膠原蛋白肽。選擇和影響酶作用的各種影響因素表明:先用CaO進(jìn)行前處理,再用堿性蛋白酶2709和中性蛋白酶AS1.398的協(xié)同作用進(jìn)行酶解,將水解液進(jìn)行過(guò)濾后,脫鉻并濃縮干燥是一條有效的工藝途徑。產(chǎn)物的檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí):粗蛋白含量≥90%。研究還提出了用阿貝折射儀測(cè)定溶液折射率來(lái)控制水解程度,并從

3、原理上對(duì)其可行性進(jìn)行了論證,試驗(yàn)結(jié)果給予了證實(shí)。 用上述產(chǎn)物——水解膠原蛋白肽作為合成肽銅的原料,研究得到的工藝條件為:反應(yīng)液pH=11,常溫反應(yīng)20 min;紅外光譜法鑒定了目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性;X-衍射和核磁技術(shù)對(duì)金屬肽進(jìn)行了測(cè)定,并表征了其三維空間結(jié)構(gòu)。 設(shè)計(jì)了毛細(xì)管層析質(zhì)譜法結(jié)合等電點(diǎn)聚焦法以及數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋蛋白質(zhì)組的聯(lián)機(jī)設(shè)備,即多維分離鑒定技術(shù),使得研究工作簡(jiǎn)單易行。設(shè)備所使用的樣品及緩沖溶液用量可微型化,樣品量減

4、少到100μL以下,緩沖液的用量?jī)H為5~10mL,此項(xiàng)技術(shù)更有利于生化樣品快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。 對(duì)分離純化后的膠原蛋白肽進(jìn)行了序列測(cè)定和空間立體結(jié)構(gòu)的表征。用現(xiàn)代分析手段對(duì)膠原蛋白肽三維立體圖譜、片斷圖譜和氨基酸組成以及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了測(cè)定和研究。直觀地觀察了氨基酸的傾向結(jié)構(gòu)和底部結(jié)構(gòu)、卡通環(huán)和主骨架、二級(jí)結(jié)構(gòu)和末端、金屬化合物的配體結(jié)構(gòu)、膠原肽的晶體結(jié)構(gòu)、水合結(jié)構(gòu)以及多聚體結(jié)構(gòu)等。 對(duì)膠原蛋白肽的功能和性質(zhì)進(jìn)行了研究和討論。在

5、膠原蛋白肽中引入硫醇基,使二硫鍵控制溶解肽在DBC中的活動(dòng)成為可能。DBC-溶解肽共軛體證實(shí)了溶解肽的活性;其在制備后至少3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定;受pH值變化的影響,其活性在熱處理后比自由酶穩(wěn)定;pH=6.3時(shí),活性最強(qiáng),而天然溶解肽的pH=9.0。 研究發(fā)現(xiàn),膠原蛋白肽濃度大于0.5mg·mL<'-1>時(shí),在465nm處的熒光強(qiáng)度有突躍:繼續(xù)增大濃度,熒光強(qiáng)度越來(lái)越大。當(dāng)膠原蛋白肽濃度增大并超過(guò)0.15mg·mL<'-1>時(shí),體系具有較

6、高的粘度,進(jìn)一步證實(shí)了膠原蛋白肽在水溶液中的聚集特性。 采用高效液相色譜法,優(yōu)化流動(dòng)相的組成,成功地將16種目標(biāo)肽與其它雜質(zhì)分離。同時(shí)成功地分析了結(jié)構(gòu)相似的小分子肽。以三氟乙酸為流動(dòng)相和酸性調(diào)節(jié)劑,考察乙腈一水不同配比對(duì)肽分離的影響,流動(dòng)相乙腈含量在2096和流速在1.0 mL·min<'-1>,可達(dá)到分離的目的。目標(biāo)肽純度范圍23.7896~89.90%,保留時(shí)間3.35~27.15min。胰島素A鏈和胰島素B鏈標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定結(jié)果

7、為:主峰純度分別為79.98%和87.69%,而產(chǎn)品的標(biāo)示純度為80.11%和89.3496,這表明本方法的分離效率較好。 建立了一種有效分離小分子肽的Tricine-SDS-PAGE的方法。調(diào)整膠中聚丙烯酰胺膠的組成,讓致密膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的交聯(lián)度為5.5%,并加入38%的尿素,可以有效地分離≤1kD的肽鏈,此方法明顯優(yōu)于常規(guī)的SDS-PAGE和現(xiàn)有的Tricine-SDS-PAGE方法。 毛細(xì)管電泳—十二烷基

8、硫酸鈉(CE-SDS)蛋白設(shè)備用于亞膠原蛋白肽的動(dòng)力學(xué)篩選分離。最佳條件為:使用36cm(或24cm)×50um的無(wú)涂層毛細(xì)管,電泳注射電壓為10kV/10s,操作電壓15kV,毛細(xì)管溫度20℃。在220nm處紫外檢測(cè),發(fā)現(xiàn)此方法有很好的重現(xiàn)性,且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均呈線性關(guān)系。膠原蛋白肽的動(dòng)力學(xué)篩選毛細(xì)管電泳(DSCE)圖在數(shù)值上、相關(guān)含量上與用庫(kù)馬西著色的SDS-PAGE凝膠掃描結(jié)果相似。 本項(xiàng)目的產(chǎn)品經(jīng)分析檢測(cè),富含19種氨基酸,蛋

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