鹵醇脫鹵酶HheC的高效表達(dá)與純化及其酶活檢測(cè)方法的研究.pdf

1、鹵醇脫鹵酶可以催化合成具有光學(xué)純的環(huán)氧化物及β-取代醇等一類高價(jià)值手性藥物中間體。鹵醇脫鹵酶的高效重組表達(dá)及純化可以更好地促進(jìn)該酶的應(yīng)用。同時(shí)，針對(duì)鹵醇脫鹵酶在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，如對(duì)某些特定反應(yīng)的低催化活性以及低立體選擇性等，需對(duì)酶進(jìn)行合理改造，以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。為此，一種方便，靈敏的高通量篩選方法是非常必要的。
　　通過PCR擴(kuò)增，將編碼鹵醇脫鹵酶的基因克隆至pBAD表達(dá)載體中，經(jīng)測(cè)序鑒定后，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10中，對(duì)其

2、重組表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高蛋白表達(dá)量。同時(shí)，對(duì)該酶在已構(gòu)建好的T7表達(dá)體系中的表達(dá)條件經(jīng)也進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析，選擇最優(yōu)條件進(jìn)行大量表達(dá)(0.5 L)，在兩種表達(dá)體系中，可溶性目的蛋白的含量均大大提高，占總蛋白含量35％左右。采用Q-Sepharose陰離子交換層析技術(shù)一步純化，獲得純度為90%的鹵醇脫鹵酶，得率分別為68和82 mg/L。
　　為了從所構(gòu)建的突變體文庫(kù)中有效地獲取有益的鹵醇脫鹵酶突變體，

3、我們建立了一個(gè)高通量的篩選方法-比色法。這個(gè)方法是依賴于苯酚紅指示劑在弱緩沖體系中，隨著酶的催化而使得質(zhì)子釋放，造成了苯酚紅在559nm條件下的吸光度值發(fā)生改變,以此檢測(cè)反應(yīng)體系中質(zhì)子的釋放量,進(jìn)而計(jì)算酶活。同時(shí),通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,使得該方法能應(yīng)用全細(xì)胞樣品并在96孔板中進(jìn)行的。方法的驗(yàn)證是使用鹵醇脫鹵酶 HheC的兩個(gè)特殊的突變體：D80N，W249F(對(duì)于底物1,3-DCP的kcat，D80N比WT低了200倍，W249F比