鹵醇脫鹵酶HheA的改造和生物催化特性的研究.pdf

1、鹵醇脫鹵酶可以催化鄰鹵醇脫鹵及非自然親和試劑介導(dǎo)的環(huán)氧化物 Cβ開環(huán)反應(yīng)，因此可用于降解環(huán)境污染物和合成手性β-取代醇，具有很高的工業(yè)應(yīng)用前景。盡管野生型HheC對短鏈底物具有很高的催化活性的對R型底物的立體偏好性，對其改造得到的優(yōu)秀突變體也已用于化工生產(chǎn)，目前仍缺少對長鏈底物具有高催化活性和高S型立體偏好性的突變體，這限制了鹵醇脫鹵酶在工業(yè)應(yīng)用中的使用范圍。野生型 HheA是獲得此種突變體的一個很好的改造模板。雖然 HheA與HheC

2、序列相似度很低，但它們的三維結(jié)構(gòu)非常相似。本文綜合對HheA和HheC的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)HheA具有與HheC類似的三個參與組成活性位點的Loop結(jié)構(gòu)。本文聚焦于此三個Loop結(jié)構(gòu)上，對HheA進(jìn)行了結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的“半理性”進(jìn)化。突變體文庫的篩選是酶進(jìn)化中難以避免卻又往往費時費力的步驟，在對HheA進(jìn)行改造的過程中，本文提出了高效率的“small-intelligent”飽和突變方法來構(gòu)建HheA的飽和突變文庫，此方法通過合理

3、設(shè)計突變引物來縮小突變體文庫的體積，減小文庫篩選的工作量。對HheA的改造最終得到了數(shù)個具有高催化活性和立體選擇性的突變體，其中的最優(yōu)突變體HheAN178A對脫鹵反應(yīng)的催化活性比野生型提高了5倍，對S型底物的立體偏好性較野生型提高了100倍以上（Ecal.值從2提高到200以上）；對環(huán)氧化物Cβ開環(huán)反應(yīng)的S型底物立體偏好性提高到野生型的50倍以上，其在脫鹵和開環(huán)反應(yīng)的動力學(xué)拆分中均具有很高的對映體過量百分?jǐn)?shù)（e.e.≥93％）。通過對