洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的高效表達(dá)、純化及其體外復(fù)性的研究.pdf

1、生物柴油作為理想的可再生清潔能源，是解決能源危機(jī)的重要途徑之一，也是未來(lái)新能源開(kāi)發(fā)的主要方向。相較于化學(xué)法，脂肪酶法制備生物柴油具有條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。但脂肪酶價(jià)格昂貴，導(dǎo)致生物柴油成本偏高，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，已嚴(yán)重制約著酶法生產(chǎn)生物柴油工藝的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，制備低成本脂肪酶對(duì)于生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。
　　 本文以理想的生物柴油專用脂肪酶——洋蔥伯克霍爾德菌G63 脂肪酶為對(duì)象，擴(kuò)增并表達(dá)了該脂肪酶及

2、其折疊酶基因，研究了折疊酶輔助下脂肪酶的體外復(fù)性過(guò)程，并對(duì)復(fù)性后的脂肪酶的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索。主要研究工作和結(jié)果如下：
　　 1．?dāng)U增了G63 脂肪酶及其折疊酶基因，并實(shí)現(xiàn)了二者在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá)。根據(jù)生物信息學(xué)方法對(duì)脂肪酶信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用pET-28a（+）質(zhì)粒對(duì)N 端刪除40個(gè)氨基酸殘基信號(hào)肽的脂肪酶進(jìn)行了表達(dá)。脂肪酶胞內(nèi)表達(dá)以包涵體形式存在，利用高壓/超聲波破碎、脫氧膽酸鈉處理的洗滌純化方法制備了

3、高純度的脂肪酶包涵體，包涵體溶解于8M的脲中，包涵體蛋白質(zhì)含量達(dá)到50mg/g cell-wetweight，包涵體用尿素溶解后濃度為4.085mg/mL。對(duì)折疊酶跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用pET-28a(+)質(zhì)粒對(duì)N 端刪除疏水性跨膜區(qū)域的折疊酶進(jìn)行表達(dá)。折疊酶融合蛋白在胞內(nèi)以可溶形式表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物N 端攜帶6×His 標(biāo)簽，利用Ni-NTA 金屬親和層析的方法制備了高純度的折疊酶，透析除去咪唑后折疊酶的蛋白質(zhì)濃度為0.67mg/mL。<

4、br>　　 2．研究了變性脂肪酶在折疊酶的輔助下的體外復(fù)性過(guò)程。對(duì)復(fù)性過(guò)程中的折疊酶/脂肪酶摩爾比、溫度、時(shí)間、pH 及蛋白質(zhì)濃度等相關(guān)因素進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：
　　 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低（0.8μg/mL）時(shí)，在復(fù)性條件（折疊酶/脂肪酶摩爾比1:1，溫度15℃，時(shí)間5小時(shí)及pH7.0）下，脂肪酶復(fù)性后比活力可達(dá)1514.0U/mg；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較高（80μg/mL）時(shí)，在復(fù)性條件（折疊酶/脂肪酶摩爾比1:1，溫度15℃，時(shí)間4