洋蔥伯克霍爾德氏菌L68菌株鄰苯二酚2，3-雙加氧酶分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、基因篩選及應(yīng)用的研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文洋蔥伯克霍爾德氏菌L68菌株鄰苯二酚2，3雙加氧酶分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、基因篩選及應(yīng)用的研究姓名：呂鵬申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：張長鎧20060326山東大學(xué)博士學(xué)位論文摘要隨著經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，引發(fā)的環(huán)境問題倍受關(guān)注。目前我國環(huán)境污染嚴(yán)峻，特別是芳香族污染物在土壤和水中的含量急劇上升，嚴(yán)重危及到了人們的生存。微生物的降解是芳香族污染物脫毒的最有效手段，亦是最終途徑。因此，從環(huán)境qJ篩選高效的芳香族污染物

2、降解菌，研究其降解途徑關(guān)鍵酶及其基因的性質(zhì)與特點，并將其應(yīng)用到環(huán)境問題中去，具有重要的理論意義與實際意義。本文從環(huán)境水體中分離到了多株苯酚降解菌，經(jīng)過復(fù)篩，選擇能夠高效降解苯酚的L68菌株進行研究。經(jīng)形態(tài)及生理生化鑒定與16SrDNA序列分析，從多相分類的角度并融合細菌系統(tǒng)分類最新研究成果，將L68菌株鑒定為Burkholderiacepacia(洋蔥伯克霍爾德氏菌、洋蔥伯克氏菌、洋蔥球莖病伯克氏菌)。對洋蔥伯克霍爾德氏菌L68菌株的苯

3、酚降解性能進行了測定，研究結(jié)果顯示，該菌株適宜生長溫度為350C左右，適宜生長pH值為70左右。在苯酚濃度為059／L的苯酚無機鹽液體培養(yǎng)基中350C、160rpm搖瓶振蕩培養(yǎng)L68菌株24h后，Jj4氨基安替比啉法不能檢測到酚。當(dāng)培養(yǎng)基中初始苯酚濃度為089／L時，L68菌株還能夠保持一定的對苯酚的降解能力。L68菌株對苯酚的降解作用主要發(fā)生在指數(shù)生長期，菌體的生長與苯酚的降解之間呈現(xiàn)正相關(guān)。固定化可以提高L68菌株對苯酚的抗性。當(dāng)培

4、養(yǎng)基中初始苯酚濃度高達1Sg／L時，固定化L68菌株仍然可以對苯酚進行降解。實驗證實，洋蔥伯克霍爾德氏菌L68菌株只產(chǎn)生鄰苯二酚23雙加氧酶，通過間位裂解途徑使鄰苯二酚及其衍生物開環(huán)。本文首次報道了來源于信克霍爾德氏菌的鄰苯二酚2，3雙加氧酶的純化與一些酶活性質(zhì)。通過正交實驗優(yōu)化了該菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件，適宜產(chǎn)酶培養(yǎng)條件確定為1％o的苯酚含量，500ml三角瓶中250mi的裝液量，O2‰的酵母粉含量，培養(yǎng)基初始DH值60，接種量25％。L

5、68菌株細胞抽提液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、SephadexG150柱層析和DEAE—SepharoseFastFlow柱層析后，經(jīng)SDSPAGE檢測，達到了電泳純，提純倍數(shù)為30966倍，收率為5543％。測得該菌株所產(chǎn)鄰苯二酚2，3雙加氧酶亞基分子量為34士lkDa，等電點為42。鄰苯二酚和4一甲基鄰苯二酚的Km值分別為49州和99州，是酶的良好底物。L68菌株鄰苯二酚2，3雙加氧酶在紫外光譜吸收上具有普通蛋白的共性。熒光光譜分析表明，酶顯