牛骨降解菌的篩選及其發(fā)酵制備膠原多肽螯合鈣的研究.pdf

1、為綜合開發(fā)利用畜禽骨骼資源,提高畜禽骨骼加工附加值,本文以牛骨為研究對象,從自然界篩選誘變高產(chǎn)膠原蛋白酶、降解骨骼的菌種,將其應(yīng)用于發(fā)酵牛骨制備功能性的補鈣產(chǎn)品一膠原多肽螯合鈣(Bovine bone collagen-derived polypeptidechelated calcium,BBCP-Ca)的研究。主要的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 從骨骼加工廠堆積骨骼處采集土樣和水樣,通過自行設(shè)計的篩選模式選出降解骨骼和產(chǎn)酶能力

2、強(qiáng)的菌株MBL13(酶活為25.60±0.93 U/mL)。經(jīng)鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。對其進(jìn)行亞硝基胍(NTG)處理和紫外線照射復(fù)合誘變,選育出一株遺傳穩(wěn)定性好,高產(chǎn)膠原蛋白酶的菌株B.cereus MBL13-U(酶活為36.80±1.39 U/mL),酶活較誘變前顯著提高了43.75％(p<0.05)。
　　 為進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)膠原蛋白酶和降解骨的能力,針對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化,以酶

3、活為指標(biāo),確定了菌株產(chǎn)酶最佳的培養(yǎng)基組成為蔗糖10.0 g/L,骨明膠20.0 g/L,CaCl20.50 g/L,NaH2PO4˙2H2O0.50 g/L,K2HPO4˙3H2O2.50 g/L。通過響應(yīng)面分析法確定了最佳發(fā)酵工藝條件為:接種量為3％,發(fā)酵溫度為37℃、pH為7.0,發(fā)酵時間為36 h、裝瓶量為25 mL/250 mL三角瓶,可獲得到最大的酶活的實驗值為48.24+0.71 U/mL,較優(yōu)化前提高了31.09％。

4、>　　 對B.cereus MBL13-U菌株所產(chǎn)膠原蛋白酶(B.cereus collagenase,BCC)的分離純化和酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。在產(chǎn)酶最佳發(fā)酵條件下,從發(fā)酵液中分離出分子量為38.0±1.5 kDa的純化酶BCC。經(jīng)酶學(xué)特性分析表明其富含天冬氨酸、賴氨酸和絲氨酸；最適的反應(yīng)溫度和pH分別為400℃和8.0；經(jīng)金屬離子、抑制劑和蛋白質(zhì)底物對酶活影響實驗,表明它是一種金屬蛋白酶,對Ⅰ型膠原蛋白底物具有顯著水解性。通過對比實

5、驗證實了其酶解牛骨膠原的能力顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的Ⅰ型膠原酶和常用于骨骼酶解的蛋白酶(p<0.05)；進(jìn)一步證實了B.cereus MBL13-U為降解牛骨的優(yōu)良菌株。
　　 為了解菌株降解牛骨的機(jī)理,探討了BCC對牛骨膠原蛋白的酶解動力學(xué)。實驗確定了牛骨膠原蛋白最佳的提取工藝條件為:乙醚低溫回流脫脂,0.48 mol/L,鹽酸脫鈣,骨粒徑為5 mm×10 mm,提取介質(zhì)為1％檸檬酸和1％胃蛋白酶復(fù)合液；經(jīng)紫外(UV)光譜、傅里葉紅外光

6、譜(Fr-IR)、差示掃描量熱法(DSC)和SDS-PAGE凝膠電泳等對其結(jié)構(gòu)表征,表明所提蛋白為保持完整三股螺旋結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原蛋白。然后以水解度(DH)為指標(biāo),實驗確定了BCC酶解牛骨膠原蛋白的優(yōu)化條件為底物濃度為30.0 g/mL,溫度為45℃,0.35％(g/100 mL)的初始酶濃度,pH為8.0,酶解的時間為6 h；并擬合出了酶解動力學(xué)方程。
　　 將單菌種B.cereus MBL13-U用于牛骨粉發(fā)酵制備牛骨膠原多肽

7、(Bovine bonecollagen-derived polypeptides,BBCP),研究結(jié)果表明發(fā)酵能顯著提高牛骨粉溶液中游離氨基酸的含量；以水解度(DH)和膠原多肽含量為指標(biāo)進(jìn)行對比實驗,確定預(yù)處理后的牛骨粉即骨素粉為發(fā)酵原料。經(jīng)響應(yīng)面分析法確定了最佳發(fā)酵條件為:接種量1％,pH值為6.0,骨素添加量為30.0 g/L,發(fā)酵溫度為27℃,發(fā)酵時間為42 h,獲得最大膠原多肽含量的實驗值為5.54±0.09 mg/mL,骨膠

8、原蛋白的轉(zhuǎn)化率約為43％。
　　 為進(jìn)一步提高多肽得率,針對混合菌種(B.cereus MBL13-U+保加利亞乳桿菌Lactobacillus bulgaricu,Lb)發(fā)酵牛骨素粉制備BBCP進(jìn)行了研究。以膠原多肽含量為指標(biāo),確定了最佳的菌種配比為MBL13-U:Lb=1:1；最佳的培養(yǎng)基組成為蔗糖含量10.00 g/L,牛骨素添加量30.00 g/L。在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法確定了最佳發(fā)酵工藝條件為:接種量2％,pH7.

9、5,發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間48 h,獲得最大膠原多肽含量的實驗值為6.72～0.07 mg/mL,骨膠原蛋白的轉(zhuǎn)化率約為52％。結(jié)果表明了混合菌種發(fā)酵效果優(yōu)于單菌種發(fā)酵。為能指導(dǎo)生產(chǎn),構(gòu)建了混合菌種的發(fā)酵動力學(xué)模型。
　　 為了獲得螯合鈣能力強(qiáng)的BBCP,對混合菌種發(fā)酵制備的BBCP進(jìn)行了超濾膜(UF)分離研究。經(jīng)過BBCP的氨基酸組成測定和UV光譜分析表明,發(fā)酵使骨中膠原蛋白降解為多肽、小分子量的短肽和氨基酸等。以膜透過速率

10、(Tv)為指標(biāo),確定了四種超濾膜(截留分子量(MWCO)分別為10 kDa、6 kDa、4 kDa、2 kDa)在分離濃度為20 g/L,的BBCP時,膜的最佳操作參數(shù)范圍:壓力為0.20 MPa-0.22 MPa,料液溫度為30℃-35℃,料液的pH為6.0-7.0,運行周期為50 min-60 min。UF分離后發(fā)酵液中以分子量為2 kDa-4kDa的BBCP為主,占了總肽量59.71％；對超濾各段經(jīng)SDS-PAGE和Sephade

11、x G-25凝膠層析分析分子量分布表明超濾能夠較好的對膠原多肽進(jìn)行分離純化。
　　 以超濾后的膠原多肽為基礎(chǔ),對BBCP-Ca的制備進(jìn)行了研究,確定了鈣源為牛骨鈣,有機(jī)沉淀劑為無水乙醇,膠原多肽為2 kDa-4 kDa超濾片段,以螯合率和螯合物得率為指標(biāo),確定最佳螯合工藝參數(shù)為:多肽與骨鈣的質(zhì)量比為4:1,pH為7.0,多肽濃度為40.0 g/L,螯合溫度和螯合時間分別為55℃和1.5 h,有機(jī)沉淀劑無水乙醇與水的體積比為8:1

12、。在此條件下,得到鈣的螯合率為47.85±2.24％,螯合物得率為77.89±3.32％。
　　 對制備的BBCP-Ca理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。通過定性檢測、成分分析、溶解度測定、持鈣能力測定,確定BBCP-Ca是一種富含多肽和鈣,且在水中有較好的溶解性和持鈣能力較強(qiáng)的多肽螯合物。通過Tricine-SDS-PAGE、質(zhì)譜(MS)、掃描電鏡(SEM)、UV光譜、熒光光譜、IR、拉曼光譜(Raman)、園二色譜(CD)、X-射線

13、能譜(EDS)、X-衍射(XRD)、核磁共振氫譜(HNMR)、HPLC對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定,結(jié)果表明:螯合鈣的膠原多肽大部分分子量在2000 Da-3326.4 Da之間,但仍含有部分膠原多肽的分子量<2000 Da；BBCP中氨基和羧基都參與了與Ca2+的配位結(jié)合,除此之外,還可能與骨鈣之間有一定的吸附作用；BBCP-Ca的二級結(jié)構(gòu)主要含有β-回折結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),幾乎不含α-螺旋結(jié)構(gòu)；且其富含鈣和P元素,由結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無定型結(jié)構(gòu)兩部分