基于單域重鏈抗體的天然噬菌體文庫的構(gòu)建及抗DON適配體的淘選.pdf

1、重鏈抗體是一種存在于駱駝、鯊魚等動(dòng)物中天然缺失輕鏈的抗體，僅由其可變區(qū)組成的抗體稱為單域重鏈抗體。單域重鏈抗體分子量小(約15kDa)，具有易表達(dá)、高水溶性、耐高溫、耐極度pH值等獨(dú)特性質(zhì)，目前已廣泛用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和檢測(cè)、抗體藥物開發(fā)等領(lǐng)域。在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域單域重鏈抗體也展現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。
　　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，又名嘔吐毒素(VT)，屬于單端孢霉烯族真菌毒素，主要是由某些鐮刀菌產(chǎn)生。該毒素常出現(xiàn)于谷物

2、及其加工產(chǎn)品中，許多國家和地區(qū)都檢測(cè)到了DON的污染。DON會(huì)引起動(dòng)物增重下降、食欲減退、營(yíng)養(yǎng)吸收率降低，并影響免疫功能。目前大部分國家對(duì)食品、谷物、飼料中的DON含量都做了嚴(yán)格規(guī)定。
　　 免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏、快速等特點(diǎn)，適合大批量樣本的檢測(cè)?，F(xiàn)有的DON免疫學(xué)檢測(cè)方法大多采用傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)（多克隆抗體和單克隆抗體），需要多次反復(fù)免疫動(dòng)物，制備過程繁瑣，來源有限，生產(chǎn)成本較高。以抗體庫技術(shù)為代表的第三代基因工程抗體技術(shù)

3、為快速、低成本的獲取和生產(chǎn)抗體提供了強(qiáng)有力的支撐。
　　 本研究采用未經(jīng)免疫的健康羊駝(Lama pacos)的免疫細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)重鏈抗體保守序列設(shè)計(jì)引物，建立基于重鏈抗體可變區(qū)基因的天然噬菌體展示文庫，并以DON-MBSA人工抗原為配基，對(duì)構(gòu)建的文庫進(jìn)行了淘選，主要研究結(jié)果如下：
　　 1、以羊駝(Lama pacos)外周血為起始材料，分別采用半巢式PCR法和巢式PCR法構(gòu)建了兩個(gè)單域重鏈抗體初級(jí)文庫SNAL

4、和NAL，兩者的實(shí)際庫容量均達(dá)到107，經(jīng)輔助噬菌體救援后獲得噬菌體展示文庫SNA-PDL和NA-PDL，滴度達(dá)1013cfu/mL。文庫多樣性分析結(jié)果顯示，文庫具有良好的多樣性，可以用于后續(xù)淘選。
　　 2、通過三輪淘選，從噬菌體文庫SNA-PDL中淘選出了三類能與DON特異性結(jié)合的克隆，分別為DON-binder1:B9、B10、B11、B13、C3、C8、C10、C15；DON-binder2：C11；DON-binder

5、3:A4、A9。間接phage-ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，前兩類克隆的OD450測(cè)定值可達(dá)后一類克隆OD450值的7～10倍，提示親和力較高。從天然噬菌體文庫NA-PDL中淘選獲得了兩種可以與DON-MBSA結(jié)合的單域重鏈抗體，其中一種可以與DON特異性結(jié)合。
　　 3、在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)重組噬菌粒pHEN-B9進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)上清中存在預(yù)期大小的蛋白(約50kDa)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法分析

6、誘導(dǎo)表達(dá)上清，結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)上清可以抑制抗DON單克隆抗體與人工抗原的結(jié)合，提示培養(yǎng)上清中的表達(dá)產(chǎn)物能與DON發(fā)生特異性結(jié)合，有望替代抗DON單克隆抗體。
　　 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新之處：
　　 1、采用針對(duì)羊駝(Lama pacos)重鏈抗體設(shè)計(jì)的引物，分別以巢式PCR法和半巢式PCR法擴(kuò)增羊駝重鏈抗體可變區(qū)全套基因，構(gòu)建了兩個(gè)天然噬菌體文庫SNA-PDL和NA-PDL，該文庫可以作為通用的技術(shù)平臺(tái)，重復(fù)用于多種抗原的篩