SpA單結(jié)構(gòu)域突變體組合噬菌體文庫的構(gòu)建及體外進(jìn)化篩選.pdf

1、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin(Ig)-binding proteins，IBPs)是由多種病原菌產(chǎn)生，與免疫球蛋白之間以非抗原形式結(jié)合，是一種重要的致病因子。其中代表分子包括有部分大消化鏈球菌表面蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L，PpL)、鏈球菌(C群和G群)蛋白G(Streptococcal protein G，SpG)和金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococca

2、l protein A，SpA)等等。這類分子是由數(shù)目不同的功能相似的單結(jié)構(gòu)域組合形成。因其獨(dú)特結(jié)合特性，該類分子在抗體純化、鑒定，抗體吸附治療和病原體特異性抗體檢測等方面應(yīng)用廣泛。
　　利用體外分子進(jìn)化獲得了由SpA A Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域和SpA C Ig單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)重新組合構(gòu)成的重組分子SpA-AC，該分子是由SpA中的E、D、A、B、C和SpG中的B2、B3各單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)重組后，利用噬菌體展示技術(shù)篩選出來的具有高結(jié)合活性的重組

3、IBPs。因此，為了獲得具有更高結(jié)合活性的免疫球蛋白結(jié)合分子，本研究對(duì)SpA的A和C結(jié)構(gòu)域上Fc結(jié)合位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建噬菌體展示文庫A1C1，對(duì)SpA的A和C結(jié)構(gòu)域上Fc結(jié)合位點(diǎn)周圍的氨基酸進(jìn)行隨機(jī)插入突變，構(gòu)建噬菌體展示文庫AI37CI20。本研究的研究目的是，期望獲得對(duì)人IgG結(jié)合能力明顯增強(qiáng)的突變體,為細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)，可用于提高病原微生物感染的抗體檢測效果，應(yīng)用分子進(jìn)化手段改進(jìn)蛋白分子功能，用于

4、提升抗體診斷試劑的檢測效果。
　　本研究共分為以下兩個(gè)部分：
　　第一部分、SpA單結(jié)構(gòu)域突變體組合文庫的構(gòu)建
　　構(gòu)建符合體外篩選要求的SpA單結(jié)構(gòu)域A在29、30位氨基酸定點(diǎn)突變文庫（A1）、SpA單結(jié)構(gòu)域C在36、37位定點(diǎn)突變文庫（C1）和SpA單結(jié)構(gòu)域A在37位后插入3個(gè)氨基酸隨機(jī)肽（AI37）、SpA單結(jié)構(gòu)域C在20位后插入3個(gè)隨機(jī)連接肽（CI20），將A1、C1隨機(jī)組合構(gòu)建的噬菌體展示文庫命名為庫A1C1

5、，將AI37、CI20隨機(jī)組合構(gòu)建的噬菌體展示文庫命名為庫AI37CI20，兩個(gè)文庫的庫容分別為3.0×106和2.0×106,滴度依次為2.3×1012和2.1×1012(TU/ml)。兩個(gè)文庫各自經(jīng)過4、5輪親和篩選，文庫進(jìn)化完全。將突變后的片段經(jīng)Xba I處理，將處理后的定點(diǎn)突變A1、C1與插入突變AI37、CI20分別與同樣處理并經(jīng)CIAP消化的pCANTAB5S連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1中，經(jīng)M13K07拯救，獲得2個(gè)AC

6、突變體展示文庫。在插入的噬菌粒上共16個(gè)單結(jié)構(gòu)域中，A1：C1：AI37：CI20個(gè)數(shù)比為5：3：4：4，具有隨機(jī)性。在插入的單結(jié)構(gòu)域片段中，AC也等比例出現(xiàn)，表明2個(gè)文庫突變位點(diǎn)堿基種類具有較好的隨機(jī)性。以上結(jié)果說明構(gòu)建的2個(gè)AC突變體組合噬菌體文庫能滿足用于體外進(jìn)化篩選要求。
　　第二部分人IgG誘導(dǎo)的SpA AC突變體組合文庫體外進(jìn)化研究
　　以人IgG包板，經(jīng)過過吸附、洗脫、擴(kuò)增幾輪重復(fù)循環(huán)，對(duì)構(gòu)建好的文庫分別進(jìn)行體

7、外分子進(jìn)化篩選，經(jīng)過4、5輪篩選，文庫中空噬菌體的完全消失，多結(jié)構(gòu)域的高度聚集，提示文庫進(jìn)化完全。在篩選后的文庫中，對(duì)出現(xiàn)的陽性克隆進(jìn)行序列測定，Phage-Elisa進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　結(jié)果：以人IgG對(duì)文庫A1C1篩選獲得AQ29K30AI29I30組合的高活性結(jié)合分子，對(duì)文庫AI37CI20篩選獲得AI-TQSA組合的高活性結(jié)合分子。
　　總結(jié)：
　　（1）本研究成功構(gòu)建了隨機(jī)定點(diǎn)突變文庫A1C1和隨機(jī)插入突變文