美達(dá)霉素生物合成途徑中的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Med-ORF10的作用機(jī)制初步研究.pdf

1、美達(dá)霉素是由包括鏈霉菌AM-7161(Streptomyces sp.AM-7161)在內(nèi)的多個鏈霉菌積累的抗生素,具有抗菌和抗癌活性,可以作為多種腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。美達(dá)霉素生物合成基因簇中的med-ORF10是美達(dá)霉素生物合成途徑中的一個功能未知基因。因?yàn)槠渫椿蛟诙鄠€抗生素基因簇中都存在,所以推測med-ORF10及同源基因在相應(yīng)抗生素合成途徑中都是必須基因,可能調(diào)控抗生素的生物合成。
　　 本研究以美達(dá)霉素生物合

2、成基因簇中的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(med-ORF10)為研究對象,綜合運(yùn)用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和分析化學(xué)等相關(guān)研究方法,通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定med-ORF10的功能,并對其作用機(jī)制展開初步研究,具體內(nèi)容如下:
　　 1.體內(nèi)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證明med-ORF10具有調(diào)控功能將含有基因med-ORF10的鏈霉菌自主復(fù)制型質(zhì)粒pHSL98經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入美達(dá)霉素產(chǎn)生菌-鏈霉菌AM-7161中進(jìn)行超量表達(dá)(Overexpression)；對超

3、量表達(dá)菌株AM-7161／pHSL98進(jìn)行發(fā)酵液及R4平板菌落產(chǎn)素(暗示美達(dá)霉素的積累)顏色觀察,初步推斷med-ORF10的超量表達(dá)可以促進(jìn)產(chǎn)素；然后通過對AM-7161／pHSL98發(fā)酵液進(jìn)行LC／MS檢測,發(fā)現(xiàn)基因med-ORF10的導(dǎo)入和過量表達(dá)使發(fā)酵上清中美達(dá)霉素產(chǎn)量增加大約2.3倍(并且一個中間產(chǎn)物的量也增加了大約6倍)。這表明med-ORF10可能是正效調(diào)控基因。
　　 2.通過RT-PCR初步確定在美達(dá)霉素基因簇

4、中受med-ORF10調(diào)控的靶基因提取美達(dá)霉素“異源野生菌株”CH999／pIK340和“異源突變菌株”CH999／pAYT64的總RNA,以看家基因23 S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參,利用半定量RT-PCR檢測兩個菌株中美達(dá)霉素基因簇中med-ORF12、med-ORF1、med-ORF11等基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)在“異源野生菌株”和“異源突變菌株”兩菌株中,這些基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異,說明這幾個基因的轉(zhuǎn)錄分別在不同程度上受到med-ORF10

5、的調(diào)控；而且“異源突變菌株”中med-ORF10的缺失使這些靶基因的轉(zhuǎn)錄水平不同程度的提高。
　　 本實(shí)驗(yàn)初步確定在異源表達(dá)體系中受到med-ORF10調(diào)控的靶基因。
　　 3.med-ORF10與靶基因啟動子的關(guān)系初步研究首先構(gòu)建了在美達(dá)霉素產(chǎn)生菌-野生型鏈霉菌AM-7161-中進(jìn)行啟動子活性檢測的陽性對照系統(tǒng):將已知功能的鏈霉菌啟動子PactⅢ克隆到啟動子探針載體pIJ8660的EGFP基因上游；通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入

6、野生型鏈霉菌AM-7161；熒光顯微鏡檢測到EGFP綠色熒光,說明這套啟動子檢測系統(tǒng)在AM-7161菌株中是適用的。
　　 利用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測了美達(dá)霉素基因簇中幾個靶基因上游的啟動子；對主要的靶基因med-ORF12上游的可能的啟動子進(jìn)行了克隆和測序,并進(jìn)一步插入到啟動子探針載體pIJ8660的EGFP基因上游,將獲得的質(zhì)粒pHSL33導(dǎo)入美達(dá)霉素產(chǎn)生菌AM-7161(野生菌株)中。
　　 以上研究結(jié)果初步確定了