高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中酵母菌株耐鹽基因GPD1的研究.pdf

1、醬油質(zhì)量是醬油行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵，而醬油品質(zhì)主要取決于醬油風(fēng)味。醬油風(fēng)味的好壞與醬油發(fā)酵的酵母菌種密切相關(guān)。但是，在高鹽稀態(tài)發(fā)酵后期的鹽水發(fā)酵中含有17％的食鹽，這種特殊的環(huán)境對微生物的生長繁殖很不利，導(dǎo)致細(xì)胞的存活率降低，這就要求生產(chǎn)中使用的酵母具有適應(yīng)惡劣環(huán)境的能力。因此本實(shí)驗(yàn)室利用基因組重排方法對S酵母(Zygosaccharomyces.rouxii)進(jìn)行基因重排，構(gòu)建了耐鹽菌株S3-2。目前對S酵母耐鹽機(jī)制的研究尚未完全，因此本文

2、從分子轉(zhuǎn)錄水平、基因序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對分析及基因過量表達(dá)等方面著手，對S和S3-2的耐鹽基因GPD1進(jìn)行研究，為闡明S酵母的耐鹽機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　本文首先構(gòu)建測序質(zhì)粒pUC19-S和pUC19-S3-2，對S和S3-2的GPD1克隆測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于S菌株，S3-2的GPD1的堿基發(fā)生了突變（ATG起始密碼子之前第66bp位置缺失一個(gè)堿基A;ORF中第665bp位置上的G突變成A;終止密碼子TAA下游第73bp位置上增

3、加了一個(gè)G堿基）。而后將測序結(jié)果翻譯成氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)。分析發(fā)現(xiàn)，S和S3-2之間有1個(gè)氨基酸發(fā)生突變即第223位精氨酸變成賴氨酸（Arg223Lys）。繼而從分子轉(zhuǎn)錄水平開始研究，通過半定量PCR(RT-PCR)對不同鹽濃度下S和S3-2酵母GPD1RNA表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，S3-2GPD1表達(dá)量明顯高于SGPD1。最后，構(gòu)建工程菌株WYS3-2和WYS及對照菌株WY，即將構(gòu)建的質(zhì)粒YEp195-S、YEp19

4、5-S3-2和YEp195轉(zhuǎn)入釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株W303-1A中，并進(jìn)行一系列指標(biāo)測定，研究發(fā)現(xiàn)，菌株WYS3-2的耐鹽性強(qiáng)于WYS，同時(shí)又都明顯強(qiáng)于對照菌株WY。
　　通過本文的研究表明:S3-2GPD1基因序列中ORF的堿基變化并未導(dǎo)致Gpd1p空間結(jié)構(gòu)的改變，因此S3-2耐滲性高于S菌株與GPD1空間結(jié)構(gòu)無關(guān);啟動(dòng)子和終止子序列的堿基變化是S3-2GPD1基因轉(zhuǎn)錄水平提高的重要原因，進(jìn)而使菌株耐滲性增強(qiáng);Gpd1p是誘導(dǎo)甘油