鞘氨醇單胞菌DP58降解吩嗪-1-羧酸(PCA)分子機(jī)理的研究.pdf

1、新型生物農(nóng)藥申嗪霉素,其有效成分為吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA),對(duì)甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治具有廣譜、高效、低毒、環(huán)境相容性好、生產(chǎn)成本低等顯著特點(diǎn)。但在生物防治過(guò)程中發(fā)現(xiàn),PCA在大田中易被降解,影響其防治效果,因此需要研究PCA的生物降解機(jī)理,了解它的環(huán)境行為,為提高申嗪霉素的防治效果、合理使用申嗪霉素奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室在此前的研究中已經(jīng)篩選出能夠高效降解PCA的菌株——鞘氨醇單

2、胞菌DP58,并對(duì)其降解PCA的特性和降解產(chǎn)物進(jìn)行了探索。本論文著重研究鞘氨醇單胞菌DP58降解PCA的分子機(jī)理。首先,提取鞘氨醇單胞菌DP58全基因組,并使用基因Shear儀將樣品隨機(jī)打斷成主帶約為6-8kb的片段、再與pUC118載體連接,構(gòu)建6-8kb的Shotgun基因文庫(kù)。經(jīng)過(guò)文庫(kù)檢驗(yàn),以鄰苯二酚為顯色指示劑從文庫(kù)中篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。然后,以PCA為唯一碳、氮源,將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于PCA無(wú)機(jī)鹽溶液中,發(fā)現(xiàn)其對(duì)PCA有一定的降解

3、能力,遂將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,運(yùn)用NCBI的BLASTn工具,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/)進(jìn)行比對(duì),了解到轉(zhuǎn)化子插入片段含有五個(gè)開(kāi)放閱讀框(orf1-orf5),其中orf2-orf4為完整的開(kāi)放閱讀框,分別與鞘氨醇單胞菌RW1(Sphingomonas sp.Strain RW1)EDO2基因簇中三個(gè)連續(xù)基因—EDO2、ORFG3和ORFG4相似,相似度達(dá)

4、到98％。將篩選出的基因,對(duì)比其在文獻(xiàn)報(bào)道中的功能,有選擇的克隆于pEASY-E1載體T7啟動(dòng)子下,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL-21中,驗(yàn)證其降解功能。由此發(fā)現(xiàn),orf2與orf4基因所編碼的酶在降解中共同起作用,并且都利用了orf3基因所編碼的電子傳遞鏈。此外,在過(guò)表達(dá)orf2- orf3- orf4基因的PCA無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,我們分離得到了不穩(wěn)定的紫色物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行了液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與之前推測(cè)的降解中間產(chǎn)物的分子