1-磷酸鞘氨醇受體表達失衡參與心梗后心室重塑的研究.pdf

1、1研究背景：
　　心室重塑是急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后發(fā)生慢性心力衰竭（heart failure，HF）的中心環(huán)節(jié)。心室重塑不僅歸因于心肌細胞的凋亡、肥大，纖維組織的形成也發(fā)揮了重要作用，目前調(diào)控纖維化發(fā)生、發(fā)展的具體機制仍未完全揭示。
　　較多文獻報道1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）與心肌缺血/再灌注、冠心病、AMI之間有密切關(guān)

2、系。目前在心臟組織發(fā)現(xiàn)有 S1P1、S1P2、S1P33種S1P受體表達。研究發(fā)現(xiàn)：在缺氧條件下S1P對心肌細胞具有保護作用；體外實驗證實S1P對心肌細胞的保護作用可能是通過S1P1作用實現(xiàn)；近期有文獻報道S1P1信號通路在調(diào)節(jié)AMI后心肌炎癥反應(yīng)過程起重要作用；另外，通過體內(nèi)、體外研究證實：S1P2、S1P3信號參與了心臟纖維化的進程。
　　基于文獻分析我們發(fā)現(xiàn)：S1P通過受體產(chǎn)生促進心肌細胞存活和加劇心肌纖維化的雙重作用。我們

3、推斷：在正常心肌組織中 S1P受體的表達處于一種平衡狀態(tài)，這種狀態(tài)參與維持心臟的正常組織形態(tài)及功能。那么，AMI后心室重塑的進程中是否存在 S1P1、S1P2、S1P3表達失衡？它們在心臟非梗死區(qū)、梗死區(qū)的表達變化趨勢是否一致？通過調(diào)節(jié) S1P受體是否能夠抑制心室重塑的發(fā)生、發(fā)展？上述問題報道較少且存在爭議，特別是梗死區(qū)上述3種受體的表達變化尚未發(fā)現(xiàn)文獻報道。本研究旨在對上述3個問題進行探討，通過在體研究干預(yù)S1P及下游信號，為改善AM

4、I患者預(yù)后提供新的思路。
　　2研究目的：
　?。?）探討 AMI后心室重塑階段非梗死區(qū)、梗死區(qū) S1P1、S1P2、S1P3的表達變化。
　?。?）通過干預(yù)S1P受體觀察對AMI后心室重塑和心功能的影響。
　　3研究方法：
　　（1）實驗一：采用體重在220g～250g雄性SD大鼠，隨機分為：假手術(shù)組、心梗組，采取開胸結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈的方法建立心梗后心衰模型。術(shù)后8周，通過HE染色、Masson染色、血清

5、BNP(brain natriuretic peptide)檢測、記錄心電圖、心功能測定等手段，對這種造模方法的可靠性進行驗證。
　?。?）實驗二：實驗動物隨機分為4組：正常對照組、1周梗死組、4周梗死組、8周梗死組，按照實驗一的方法構(gòu)建模型。采用實時熒光定量 PCR技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）的檢測方法，對正常心臟以及心梗后1周、4周、8周三個時間點大

6、鼠心臟組織中S1P1、S1P2、S1P3mRNA和蛋白表達進行檢測。
　　（3）實驗三：實驗動物隨機分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、AMI組、Sham+SEW2871組、AMI+SEW2871組。對Sham+SEW2871組、AMI+SEW2871組，經(jīng)口給予S1P1特異性激動劑SEW2871，劑量：7mg/kg/d，直至處死前。術(shù)后8周，通過心臟超聲測定心功能，激光多普勒檢測心臟微循環(huán)灌注，ELISA法檢測血清心衰標志物BNP

7、變化，Masson染色評估膠原容積分數(shù)。
　?。?）統(tǒng)計學方法：計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（Mean±SD）的表示方法，利用GraphPad Prism6.02軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用t檢驗對單因素兩組之間進行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析法對單因素多組間進行兩兩比較，當 P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。
　　4研究結(jié)果：
　?。?）實驗一：
　　①結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈的造模方法能夠保證較高的動物存活率，本研究中假手

8、術(shù)組、心梗組大鼠存活率分別為：75.0％、72.5%。
　?、谛墓＝M左冠脈結(jié)扎5分鐘后可記錄到心電圖I、II、aVL導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)J點上移超過0.1mv，ST段抬高（多為弓背向上型）0.2mv以上，假手術(shù)組無上述變化。
　?、坌g(shù)后8周心臟超聲檢測：心梗組左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)：29.20±1.75%，假術(shù)組：33.17±1.32%，心梗組LVFS低于

9、假手術(shù)組(P＜0.01)；心梗組左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）：63.24±1.88%，假手術(shù)組：71.12±0.79%，心梗組 LVEF均低于假手術(shù)組(P＜0.01)。
　?、蹾E染色可見梗死部位心室壁明顯變薄，肌纖維被疏松結(jié)締組織取代，殘存肌細胞增生，成纖維細胞增生，血管增生充血明顯。
　?、軲asson染色顯示心肌梗死區(qū)域殘存心肌之間纖維瘢痕形成，呈交錯分

10、布。
　?、扌g(shù)后8周，心梗組與假手術(shù)組血清BNP水平分別為：648.44±9.37ng/mL、541.65±33.34ng/mL，心梗組明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。
　?。?）實驗二：
　?、僭贏MI后1周、4周、8周三個時間點，分別檢測S1P1的mRNA和蛋白表達，并與正常對照心肌組織（ mRNA表達:33.34±6.80，蛋白表達：295.3±57.22 ng/g）比較，發(fā)現(xiàn)：梗死區(qū)中S1P1的mRNA和蛋白

11、表達水平在1周組（mRNA表達:28.47±8.01，蛋白表達：240.7±47.22ng/g）、4周組（mRNA表達:13.70±5.25，蛋白表達：137.4±17.04 ng/g）均降低（P＜0.05）。
　?、谠贏MI后1周、4周、8周三個時間點，分別檢測S1P2的mRNA和蛋白表達，非梗死區(qū)中的S1P2mRNA表達水平在對照組（1405±169.60）和心梗不同時間點之間比較均無顯著差異。相比之下，梗死區(qū)S1P2mRNA

12、變化趨勢卻極為顯著，降低趨勢持續(xù)至術(shù)后4周（163.6±16.45）（P＜0.01）；非梗死區(qū) S1P2蛋白表達在心梗1周、4周組呈下降趨勢，4周組(91.21±15.30ng/g)較對照組(180.9±34.00ng/g)明顯下降（P＜0.01）, S1P2蛋白在梗死區(qū)不同組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　?、墼贏MI后1周、4周、8周三個時間點，分別檢測S1P3的mRNA和蛋白表達，非梗死區(qū)的S1P3mRNA表達在梗死

13、1周（565.7±30.85）較正常對照組（434.5±15.61）顯著升高（P＜0.05），至術(shù)后8周降低至正常對照組水平；梗死區(qū)S1P3mRNA表達在1周組升高（P＜0.01）,變化特點與非梗死區(qū)變化趨勢相似；S1P3蛋白在梗死區(qū)和非梗死區(qū)表達均上調(diào)（P＜0.05）。
　　（3）實驗三：
　?、偈中g(shù)8周后，檢測心臟多譜勒超聲顯示：AMI+SEW2871組與AMI組比較， LVFS、LVEF均增高，其中LVFS指標 AMI

14、+SEW2871組（32.12±0.89%）較AMI組（29.65±1.49%）增高（P＜0.01），LVEF測量顯示AMI+SEW2871組（66.32±1.60%）也較AMI組（62.32±1.69%）增高（P＜0.01）。
　?、谑中g(shù)8周后，激光多普勒血流儀掃描各組大鼠心臟表面血流量發(fā)現(xiàn)AMI+SEW2871組中的紅色和黃色信號較AMI組明顯增多，藍色信號減少，測定灌注單位（perfusion units，PU）值：Sham

15、組1015±96.17、AMI組688.9±70.19、 Sham+SEW2871組985.4±46.47、 AMI+SEW2871組823.2±110.80，AMI+SEW2871組PU值較AMI組增高（P＜0.05）。
　?、凼中g(shù)8周后，血清BNP檢測，AMI+SEW2871組（638.2±38.99 ng/mL）較AMI組（650.7±34.06 ng/mL）有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。
　?、苁中g(shù)8周后， Mas

16、son染色經(jīng)圖像分析獲得膠原容積分數(shù)（%）， AMI+SEW2871組（梗死區(qū)：34.33±4.43%，非梗死區(qū)：16.83±2.17%），AMI組（梗死區(qū)：40.80±6.92%，非梗死區(qū)：20.61±2.71%），梗死區(qū)和非梗死區(qū)的膠原容積分數(shù)顯示，AMI+SEW2871組較AMI組均有降低趨勢，但在僅梗死區(qū)兩組之間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　5研究結(jié)論：
　?。?）首次較完整闡述了S1P1、S1P2、S1P33