1-磷酸鞘氨醇在燒傷誘導(dǎo)的高血管通透性中的作用.pdf

1、目的： 燒傷后血管通透性升高是引起低血容量性休克和多器官功能衰竭的重要原因，因此有效防治血管通透性的升高是燒傷治療中的關(guān)鍵。由于血管通透性升高的機(jī)制還未闡明，目前尚未找到防治血管通透性升高和減少燒傷補(bǔ)液的有效措施，探尋血管通透性升高的機(jī)制及尋找一種新的降低血管通透性的藥物顯得非常重要。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，S1P)來(lái)源于細(xì)胞膜鞘磷脂的分解代謝，是血漿的一個(gè)重要組成成分，主要由血小板貯存分泌

2、。目前已證明1-磷酸鞘氨醇是內(nèi)源性血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能保護(hù)因子之一，但對(duì)燒傷后內(nèi)皮屏障功能的影響未有報(bào)導(dǎo)。本研究擬應(yīng)用顯微外科技術(shù)、熒光比例技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)和細(xì)胞免疫組化等方法，從整體、組織和細(xì)胞三個(gè)層次研究1-磷酸鞘氨醇對(duì)燒傷后高血管通透性的作用，為臨床燒傷治療提供新的思路。 方法： 1.燒傷模型的制備 符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)BABL/c雄性小鼠30只，6～8周齡，18～22g，背部剪毛約

3、30％體表面積，8％硫化鈉水溶液脫去殘留毛，保鮮袋內(nèi)裝92℃水，袋外溫度為90℃，假燒傷組保鮮袋內(nèi)為37℃水，使其充分接觸脫毛處9秒，至Ⅱ～Ⅲ燙傷，燙傷后立即通過(guò)肌肉注射給予每只小鼠生理鹽水1ml(假燒傷組不予補(bǔ)液)。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)所用的主要S1P代謝制劑為兩種：S1P和抑制S1P生成的N,N'-二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethylsphingosine，DMS)。整體、組織和細(xì)胞水平三個(gè)層次實(shí)驗(yàn)分組均如下：

4、符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)BABL/雄性小鼠30只，6～8周齡，18～22g或SPF級(jí)Wistar雄性大鼠30只，三月齡，體重160～200g，均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分成6組，每組5只：①假燒傷組；②假燒傷+S1P組；③假燒傷+DMS組；④燒傷組；⑤S1P+燒傷組；⑥燒傷+S1P組。 3.在體腸系膜微靜脈通透性的觀察 剖腹尋找合適的腸系膜微靜脈(直徑10～50μm，血管周圍無(wú)脂肪細(xì)胞包裹)，正置熒

5、光顯微鏡、實(shí)驗(yàn)室分析軟件NIS-ElementBR連續(xù)觀察分析血管內(nèi)熒光物質(zhì)滲出情況。血管內(nèi)的熒光密度值(Ii)和血管外滲出的熒光密度值(Io)分別由軟件測(cè)定，血管通透性由Ii和Io的比率決定，表示為Pa，其Pa值越大表示通透性越高。觀察時(shí)間為燒傷后20～50min。 4.游離微靜脈的插管、灌流和通透性測(cè)定 利用特制的玻璃套管對(duì)游離的單根皮膚微靜脈兩端插管，模擬體內(nèi)循環(huán)狀態(tài)進(jìn)行血清和藥物的灌注。用圖像分析軟件Imagin

6、gWorkbench2計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)血管內(nèi)外熒光強(qiáng)度，其比值的變化速率由通透系數(shù)Pa表示，Pa值越大表示通透性越高。 5.激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)腸系膜微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的F-actin免疫熒光染色。 6.激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和VE-cadherin的雙重免疫熒光染色。 結(jié)果： 1.整體水平 (1)燒傷模型在補(bǔ)液后6h的血壓與假燒傷組沒(méi)有顯著差異。 (2)增加

7、假燒傷組小鼠體內(nèi)的S1P濃度(假燒傷+S1P組)其Pa值與單純假燒傷組在各時(shí)間點(diǎn)比較沒(méi)有顯著性差異，而給予DMS抑制S1P生成后(假燒傷+DMS組)，與單純假燒傷組比較血管外熒光物質(zhì)滲出增加，Pa值在50min時(shí)為0.82±0.07，顯著高于假燒傷組0.66±0.12(P<0.05)。 (3)燒傷后血管通透性明顯升高，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)血管周邊大量滲出的熒光物質(zhì)，隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增多。燒傷后25minPa值為0.74±0.07，

8、50minPa值為0.91±0.07，均顯著高于假燒傷組(P<0.01)。 (4)燒傷前30min給予S1P(S1P+燒傷組)，燒傷后25～50min可見(jiàn)血管周圍僅有少量熒光物質(zhì)滲出，其Pa值在燒傷50分鐘時(shí)為0.66±0.10，與單純燒傷組比較顯著降低(P<0.01)；與假燒傷組沒(méi)有顯著性差異。燒傷后給予S1P(燒傷+S1P組)，血管周圍仍見(jiàn)大量熒光物質(zhì)滲出，其Pa值與假燒傷組比較仍顯著升高(P<0.05)。 2.組織

9、水平 (1)正常血清灌流時(shí)游離微靜脈的Pa值為0.85±0.53，給予S1P灌流30min后Pa值與正常組比較無(wú)顯著性差異，而給予DMS抑制S1P后Pa值升高，為2.84±0.19，與正常組比較顯著升高(P<0.05)。燒傷血清灌流可引起單根游離微靜脈通透性升高，Pa值為2.54±0.46，與正常組比較顯著升高(P<0.05)，預(yù)給予S1P灌流或后給予S1P治療均可抑制燒傷血清誘導(dǎo)的高血管通透性，Pa值分別為0.73±0.26、

10、0.76±0.19，與正常組沒(méi)有顯著性差異，而與燒傷組比較均有顯著性差異(P<0.05)。 (2)激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)結(jié)果示：在假燒傷組腸系膜微靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin主要分布在細(xì)胞周邊，線條完整連續(xù)，界線清晰，整根血管顯示出內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；假燒傷后給予S1P同樣可見(jiàn)整根血管顯示縱形的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)；而給予DMS抑制S1P生成后血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不再完整，細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)離散；燒傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變得模糊難辨

11、；預(yù)防性先給予S1P可抑制燒傷后的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，可見(jiàn)完整的內(nèi)皮細(xì)胞骨架，線條完整清晰，與假燒傷組形態(tài)一致；燒傷后再給予S1P治療無(wú)法完全逆轉(zhuǎn)燒傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞F-actin形態(tài)改變，血管只顯示殘留斷裂的F-actin。 3.細(xì)胞水平 (1)S1P對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和VE-cadhedn形態(tài)學(xué)影響的劑量效應(yīng)：隨S1P濃度增大(0.5μmol/L～1μmol/L)，F(xiàn)-actin外周致密帶變清晰，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，V

12、E-cadhedn具有與F-actin相似的變化；當(dāng)S1P的濃度為10μmol/L時(shí)F-actin外周致密帶變得粗糙不規(guī)則，VE-cadherin出現(xiàn)鋸齒樣斷裂。 (2)燒傷血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和VE-cadherin形態(tài)學(xué)影響的時(shí)間效應(yīng)：隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維明顯增多，外周致密帶越來(lái)越模糊，至6h已無(wú)法辨清細(xì)胞形態(tài)；VE-cadherin由細(xì)胞周邊向胞漿彌散越來(lái)越明顯，至6h細(xì)胞周邊的VE-cadherin網(wǎng)

13、絡(luò)結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)分布內(nèi)化現(xiàn)象。 (3)S1P對(duì)燒傷血清引起內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和VE-cadherin形態(tài)學(xué)改變的作用：正常內(nèi)皮細(xì)胞中F-actin和VE-cadherin二者重疊分布于細(xì)胞周邊，形成外周致密帶；S1P刺激后二者外周致密帶變得更加光滑，線條清晰連續(xù)；而給予DMS刺激后F-actin外周致密帶發(fā)生斷裂，細(xì)胞骨架難辨，VE-cadherin發(fā)生類似變化；燒傷血清刺激后內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)大量應(yīng)力纖維形成，VE-eadher

14、in發(fā)生斷裂；預(yù)防性給予S1P可抑制此改變，與正常內(nèi)皮細(xì)胞分布類似；先用燒傷血清刺激再給予SlP可逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和VE-cadherin的形態(tài)改變，與正常內(nèi)皮細(xì)胞分布類似。 結(jié)論： 1.在整體水平，S1P對(duì)正常血管通透性起保護(hù)作用；燒傷可導(dǎo)致血管通透性升高；S1P在整體水平上可預(yù)防燒傷后血管通透性的升高。 2.在組織水平，S1P可維持微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin的正常形態(tài)；燒傷導(dǎo)致微靜脈內(nèi)皮細(xì)

15、胞F-actin外周致密帶斷裂，引起血管通透性升高；S1P可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)燒傷后單根游離微靜脈通透性的升高。 3.在細(xì)胞水平，1-磷酸鞘氨醇促使內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin和粘附連接蛋白VE-cadherin在細(xì)胞周邊的分布，在一定濃度范圍內(nèi)成劑量效應(yīng)(0.5μmol/L～1μmol/L)，而濃度為10μmol/L時(shí)則導(dǎo)致應(yīng)力纖維形成和VE-cadherin內(nèi)化；燒傷血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞F-actin重排和粘附連接蛋白VE-cadhe