Moesin在AGE介導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管通透性變化中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 血管通透性的增高是糖尿病視網(wǎng)膜病變的一個(gè)標(biāo)志性事件，是其發(fā)生的最初表現(xiàn)和導(dǎo)致其他后續(xù)改變的病理基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損是糖尿病視網(wǎng)膜病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)。在糖尿病微血管病的發(fā)生過(guò)程中，高血糖所引起的蛋白質(zhì)非酶糖基化形成的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)的作用已引起廣泛的重視。本研究通過(guò)制備視網(wǎng)膜血管通透性增高的小鼠，利用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)、免疫組化、蛋白磷

2、酸化檢測(cè)、RT-PCR、激酶特異性抑制劑和通透性測(cè)定的方法，在整體水平研究在AGE引起的視網(wǎng)膜血管通透性增高中，血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白及其磷酸化在其中的作用，探討AGE引起moesin改變的上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。對(duì)moesin蛋白在AGE介導(dǎo)的視網(wǎng)膜微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能變化中作用的闡明，將有助于探討AGE相關(guān)疾病，特別是糖尿病性視網(wǎng)膜病以及糖尿病性微血管病的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.AG

3、E-MSA的體外制備將小鼠血清白蛋白(MSA)、葡萄糖(D-Glucose)溶解在PBS(pH7.2，0.4 mol/L)中，再加入青霉素和慶大霉素等。終濃度：葡萄糖0.2 mol/L、MSA3.5 mg/mL、青霉素90.3 U/mL、慶大霉素0.07 mg/mL、PMSF50μmol/L、EDTA0.001 mol/L、Sodium Azide0.001 mol/L?；旌衔镉?.2μm濾器過(guò)濾：放置在37℃，8周。以相同條件但不含葡

4、萄糖的緩沖液孵育的鼠血清白蛋白作為對(duì)照。8周后將混合液用Millipore15 mL超濾柱濃縮，Pierce Endotoxin Removing Gel去內(nèi)毒素，Millipore0.22μm濾器除菌。用熒光分光光度法測(cè)定AGE含量。AGE-MSA中含有AGE72.50 U/mg protein，而對(duì)照的天然小鼠血清白蛋白中只含有AGE0.85 U/mgprotein。
　　 2.對(duì)照組小鼠和AGE-MSA刺激組小鼠的處理符合

5、國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠60只，10～12周齡，16～20g。每天定時(shí)腹腔注射天然小鼠血清白蛋白或AGE-MSA10 mg/kg，連續(xù)注射7天。
　　 3.p38抑制劑組和ROCK抑制劑組的處理SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠60只，10～12周齡，16～20g，在腹腔注射AGE-MSA(10 mg/kg)前半小時(shí)預(yù)先注射SB203580(ip，1 mg/kg)或Y27632(ip，5mg/kg)，連續(xù)7天

6、。
　　 4.視網(wǎng)膜血管通透性測(cè)定小鼠麻醉后固定，從小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)45 mg/kg，循環(huán)1小時(shí)，在1分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘和1小時(shí)取血，每次20μL，測(cè)定血漿中伊文思藍(lán)濃度，獲得時(shí)間平均伊文思藍(lán)濃度。伊文思藍(lán)循環(huán)1小時(shí)結(jié)束后，打開(kāi)胸腔在右心房開(kāi)口，在左心室灌注枸櫞酸鉀(37℃)，沖洗視網(wǎng)膜血管中的血液。灌注2分鐘后取出眼球，分離視網(wǎng)膜，在真空離心機(jī)干燥視網(wǎng)膜后稱(chēng)取干重。將視網(wǎng)膜放入甲酰胺中，70℃18小時(shí)，萃

7、取視網(wǎng)膜中的伊文思藍(lán)。7000 rpm離心取上清，測(cè)定在632 nm吸收光下伊文思藍(lán)的濃度。血視網(wǎng)膜屏障的破壞可以通過(guò)以下公式計(jì)算結(jié)果，單位表示為μL plasma×g retinal dry、wt-1·h-1。
　　 伊文思藍(lán)(μg/視網(wǎng)膜干重(g)/時(shí)間平均伊文思藍(lán)濃度(μg/μL)×循環(huán)時(shí)間(h)5.小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin的觀測(cè)小鼠麻醉后固定在手術(shù)臺(tái)，分離頸總動(dòng)脈和頸靜脈，從頸總動(dòng)脈近心端向遠(yuǎn)心端插管，通過(guò)頸

8、總動(dòng)脈向眼球依次灌注Krebs液、3％多聚甲醛、0.1 mol/LPBS、Triton-X-100、0.1 mol/L PBS、羅丹明鬼筆環(huán)肽和0.1 mol/L PBS。灌流后，取出眼球放入4％多聚甲醛固定。約12小時(shí)后，取固定好的眼球分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜平鋪在petri小皿中央，蓋上蓋玻片，用樹(shù)脂封片。用激光共聚焦顯微鏡掃描觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架F-actin的變化。
　　 6.Western Blot檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞

9、moesin蛋白及其磷酸化水平將小鼠麻醉后作眼球摘除，將眼球沿角膜緣剪開(kāi)，去除玻璃體，分離視網(wǎng)膜(不含色素上皮層)，將視網(wǎng)膜放入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中，組織勻漿機(jī)冰上勻漿10 min，然后冰上靜置裂解30 min，離心取上清，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后采用Tris/甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法獲得印跡膜，將用二抗結(jié)合后的印跡膜放入TBST中漂洗3×5 min后，濾紙小心吸干膜上液體，

10、在膜上加適量配制好的ECL發(fā)光底物(Amersham，美國(guó))，使其于印跡膜充分作用接觸，吸去多余液體，于柯達(dá)2000工作站曝光顯影保存。
　　 7.免疫組化分析視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白磷酸化將小鼠眼球取下經(jīng)固定后石蠟包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復(fù)后采用兩步法檢測(cè)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白及其磷酸化的水平，在200和800倍光鏡下觀察。
　　 8.RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白mRNA

11、水平按照6的方法取眼球分離視網(wǎng)膜，放入Trizol中，冰上勻漿約1-2 min后室溫放置5min，使其充分裂解。提取組織總mRNA后測(cè)定RNA濃度后-80℃保存。以提取的總RNA為模板，加入小鼠moesin蛋白和β-actin蛋白基因cDNA的上下游引物，進(jìn)行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，用0.5μg/mL的溴化乙錠溶液染色。在紫外燈觀察下，采用凝膠成像分析系統(tǒng)成像分析。
　　 結(jié)果
　　 1.AGE

12、-MSA對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管通透性的影響及機(jī)制1.1.AGE-MSA對(duì)視網(wǎng)膜血管通透性的影響對(duì)照組伊文思藍(lán)的滲出量是1.938±0.353，AGE-MSA組伊文思藍(lán)的滲出量是5.438±0.801，AGE-MSA組視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)的滲出量較對(duì)照組顯著增多(P=0.000)。結(jié)果提示AGE刺激后引起了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的破壞和通透性的升高。
　　 1.2.AGE-MSA對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin的影響對(duì)照組視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮

13、細(xì)胞骨架蛋白F-actin分布在細(xì)胞周邊，線條完整連續(xù)，界限清晰；AGE-MSA刺激組F-actin線條不完整連續(xù)，出現(xiàn)缺損。結(jié)果提示AGE-MSA的刺激引起了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin排列的異常。
　　 1.3.AGE-MSA刺激后視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞Moesin蛋白及其磷酸化水平的變化Western Blot結(jié)果顯示AGE-MSA組的小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白的磷酸化水平較對(duì)照組顯著增高(P=0.00

14、1)，但moesin蛋白的水平無(wú)顯著增高(P=0.805)。提示AGE刺激引起了moesin磷酸化水平明顯增高。
　　 免疫組化結(jié)果顯示：AGE-MSA組視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的phos-moesin染色程度(與moesin比較)較對(duì)照組強(qiáng)，提示其磷酸化水平增加。
　　 1.4.RT-PCR檢測(cè)晚期糖基化終產(chǎn)物刺激后moesin蛋白mRNA表達(dá)水平RT-PCR檢測(cè)到AGE-MSA組較對(duì)照組moesin蛋白的mRNA水平無(wú)顯

15、著差別(P=0.073)。
　　 2.AGE-MSA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白磷酸化的上游信號(hào)通路研究2.1.抑制p38 MAPK通路對(duì)AGE-MSA介導(dǎo)的moesin磷酸化的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AGE刺激的小鼠視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞p38 MAPK的磷酸化水平顯著提高(P<0.05)；SB203580預(yù)處理組的phos-p38水平較單純AGE刺激組顯著降低(P=0.000)，提示AGE刺激引起了p38 MAPK

16、的磷酸化激活。
　　 在證明了AGE刺激導(dǎo)致了視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin磷酸化的基礎(chǔ)上，結(jié)果進(jìn)一步顯示，SB203580預(yù)處理組的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin的磷酸化水平顯著低于單純AGN激組(P=0.002)，提示p38 MAPK的磷酸化激活參與介導(dǎo)了moesin的磷酸化。
　　 2.2.抑制ROCK通路對(duì)AGE-MSA介導(dǎo)的moesin磷酸化的影響結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AGE-MSA刺激的小鼠視網(wǎng)膜微血管

17、細(xì)胞ROCK的磷酸化水平明顯提高(P=0.000)；Y27632預(yù)處理組的phos-ROCK水平較單純AGE組明顯降低，提示AGE刺激引起了ROCK的磷酸化激活。
　　 在證明了AGE-MSA刺激導(dǎo)致了視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin磷酸化的基礎(chǔ)上，結(jié)果進(jìn)一步顯示，Y27632預(yù)處理組的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin的磷酸化水平明顯低于單純AGE刺激組(P=0.005)，提示ROCK磷酸化激活參與介導(dǎo)了moesin的磷酸化。<

18、br>　　 2.3.抑制p38 MAPK和ROCK磷酸化活性對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白mRNA水平的影響對(duì)照組、AGE-MSA刺激組、p38 MAPK阻斷劑組和ROCK阻斷劑組moesin蛋白mRNA水平無(wú)顯著差別(P=0.127)。結(jié)果提示，抑制p38 MAPK和ROCK的磷酸化激活不影響moesin蛋白的表達(dá)。
　　 2.4.抑制p38和ROCK的磷酸化激活對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞F-actin形態(tài)變化的影響AG

19、E-MSA組F-atlcin線條不完整連續(xù)。給予p38抑制劑SB203580或ROCK抑制劑Y27632可抑制AGE刺激后的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，可見(jiàn)比較完整的細(xì)胞骨架，線條比較完整清晰，與對(duì)照組形態(tài)基本一致。結(jié)果提示抑制p38 MAPK和ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以防止小鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架F-actin的重新分布。
　　 2.5.抑制p38和ROCK的磷酸化激活對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響p38 MAPK阻斷劑組

20、伊文思藍(lán)的滲出值是2.576±0.388，與AGE-MSA刺激組伊文思藍(lán)的滲出值5.438±0.801相比有顯著性差異(P=0.000)，p38MAPK阻斷劑預(yù)處理顯著減少了小鼠視網(wǎng)膜血管伊文思藍(lán)的滲出，降低了視網(wǎng)膜血管的通透性；ROCK阻斷劑組伊文思藍(lán)的滲出值是2.565±0.528，與AGE-MSA組相比有顯著性差異(P=0.000)，ROCK阻斷劑預(yù)處理顯著減少了小鼠視網(wǎng)膜血管伊文思藍(lán)的滲出，降低了視網(wǎng)膜血管的通透性。
　　

21、 結(jié)論：
　　 1.掌握了制備AGE引起視網(wǎng)膜血管通透性增加的小鼠的方法，開(kāi)展了整體灌注的F-actin染色法，為今后的有關(guān)研究打下了方法學(xué)的基礎(chǔ)。
　　 2.AGE可以引起視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架F-actin的重新分布，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管通透性增加，血管視網(wǎng)膜屏障破壞，提示糖尿病視網(wǎng)膜病變中AGE可能起著重要作用。
　　 3.AGE刺激導(dǎo)致了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞moesin蛋白磷酸化水平的明顯升高。