內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與休克血管通透性改變的關(guān)系及其作用機(jī)制.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(EndoplasmicReticulum,ER)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器,對細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變極為敏感,氧化應(yīng)激、缺血損傷、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂以及正?；蝈e誤折疊蛋白質(zhì)高表達(dá)均可引起其功能紊亂,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外的因素打破了蛋白質(zhì)合成、成熟與降解之間的穩(wěn)態(tài),出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài),稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(EndoplasmicReticulumStress,ERS)。ERS早期主要是糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-r

2、egulatedproteins78,GRP78)、GRP94、鈣網(wǎng)蛋白、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingprotein-homologousprotein,CHOP)等蛋白表達(dá)上調(diào)?，F(xiàn)有研究表明,ERS分子主要參與細(xì)胞的分化與凋亡調(diào)節(jié)。而ERS分子是否也參與細(xì)胞的功能調(diào)控,目前還不清楚。有證據(jù)表明,GRP78和CHOP可能參與了調(diào)節(jié)IP3R的活性,影響ER內(nèi)Ca2+的釋放,從而可能參與調(diào)

3、節(jié)膿毒性休克血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的重構(gòu),引起血管通透性的改變。而內(nèi)毒素休克模型中血管通透性的改變是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、CHOP是否通過IP3受體途徑改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度,參與休克血管通透性改變的調(diào)節(jié),需要進(jìn)一步研究。
　　據(jù)此,本研究利用膿毒性休克大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,研究GRP78和CHOP蛋白表達(dá)的變化及其與血管通透性改變的關(guān)系。體外毒胡蘿卜素誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,探討細(xì)胞水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與IP3受

4、體介導(dǎo)鈣離子濃度改變引起細(xì)胞通透性改變的關(guān)系。
　　主要實驗方法:
　　實驗分為體內(nèi)實驗和體外實驗。
　　體內(nèi)實驗:盲腸結(jié)扎穿孔法誘導(dǎo)膿毒性休克,建立大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,按照盲腸結(jié)扎穿孔后時間長短分為五組,CLP1h組,CLP2h組,CLP4h組,CLP6h組,CLP8h組,將其與空白對照組,CLP6h+?；撬崽幚斫M一起構(gòu)成實驗分組。牛磺酸200mg/kg(4％?；撬崛芙庥?.9%的生理鹽水)于CLP術(shù)前經(jīng)由股靜脈注入

5、大鼠體內(nèi),分光光度計法測量滲漏在肺組織血管外的異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白,檢測各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激血管通透性改變。WesternBlot法測量肺血管內(nèi)GRP78和CHOP蛋白的表達(dá),統(tǒng)計學(xué)分析GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)與血管通透性改變的相關(guān)性。WesternBlot法測量各組大鼠肺血管內(nèi)IP3受體蛋白的表達(dá)變化,利用鈣探針鈣離子成像方法檢測血管內(nèi)鈣離子含量,將得到的各組蛋白含量、鈣離子濃度、血管通透性變化進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,從而探討膿

6、毒性休克內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否通過IP3鈣離子通路調(diào)節(jié)血管通透性。
　　體外實驗:用4只成年健康大鼠的肺動脈主干取血管內(nèi)皮片進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代,體外毒胡蘿卜素誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μmol/L毒胡蘿卜素,分別作用1、2、4、6、8小時。按照毒胡蘿卜素作用時間長短分為1h、2h、4h、6h、8h組。Transwell法測量各組血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變,激光共聚焦檢測F-actin形態(tài)及分布,Wester

7、nBlot法測量細(xì)胞內(nèi)IP3受體蛋白表達(dá),鈣探針法檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變,并用統(tǒng)計學(xué)分析得出血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性、IP3受體蛋白、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度三者改變的相關(guān)性,了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的血管通透性改變與IP3受體鈣離子通路的相關(guān)性。
　　主要研究結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗
　　(1)膿毒性休克大鼠血管通透性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)變化:CLP術(shù)后1h,各組反應(yīng)肺血管通透性的熒光滲透率開始升高。隨著時間的延長,盲腸造瘺術(shù)組肺血管

8、熒光物質(zhì)滲透率逐漸升高,術(shù)后8小時達(dá)到高峰;CLP術(shù)后1h,GRP78蛋白、CHOP蛋白的表達(dá)開始升高,隨著術(shù)后時間的延長,GRP78和CHOP蛋白表達(dá)持續(xù)上升。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,膿毒性休克大鼠各組反應(yīng)血管通透性的熒光物質(zhì)滲透率指標(biāo)與GRP78和CHOP蛋白表達(dá)含量呈顯著正相關(guān)。
　　(2)血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維變化:CLP術(shù)后1h,通過鬼筆環(huán)肽染色,各組膿毒性休克大鼠肺動脈主干提取的內(nèi)皮細(xì)胞可見F-actin主要分布在細(xì)胞膜的周邊,

9、向外突出呈毛刺狀,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見密集的應(yīng)力纖維,隨著作用時間的延長,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化,應(yīng)力纖維變多,出現(xiàn)不規(guī)則排列,向周邊的毛刺狀突起明顯增多。對照組F-actin表達(dá)不明顯,細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則。
　　(3)IP3受體表達(dá):膿毒性休克大鼠肺組織中IP3R-I蛋白的表達(dá)也隨休克時間延長而增加。CLP術(shù)后1h,大鼠肺組織IP3R-I蛋白表達(dá)量較對照組增加,隨著術(shù)后時間的延長,IP3R-I蛋白表達(dá)持續(xù)上升,呈遞增趨勢。統(tǒng)計學(xué)分析表明,GRP7

10、8和CHOP蛋白的表達(dá)與IP3R-I表達(dá)呈正相關(guān)。
　　(4)膿毒性休克大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度變化:CLP1h后,膿毒性休克大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中鈣離子濃度較對照組增加,隨著術(shù)后時間的延長,內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度顯著上升。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子蛋白與鈣離子濃度變化呈正相關(guān),IP3R-I表達(dá)與鈣離子濃度變化也呈正相關(guān)。
　　(5)?；撬岣深A(yù)作用:與CLP6h組進(jìn)行比較,?；撬岣深A(yù)組各項指標(biāo)出現(xiàn)明顯的下降趨勢,CLP術(shù)前給予牛磺酸(200

11、mg/kg,股靜脈注入),6h后與單純CLP組6h進(jìn)行比較。?；撬岣深A(yù)后,血管通透性熒光滲透率較單純CLP6h組降低,GRP78、CHOP和IP3R蛋白的表達(dá)較單純CLP6h組顯著下調(diào),鈣離子濃度也較CLP6h組顯著降低。
　　2.體外實驗
　　(1)血管通透性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)變化:隨著毒胡蘿卜素作用時間的延長,血管通透性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)均呈遞增趨勢,在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μmol/L毒胡蘿卜素作用1h,各組反

12、應(yīng)肺血管通透性的熒光滲透率即開始升高。隨著作用時間的延長,肺血管熒光物質(zhì)滲透率呈線性遞增。同樣,GRP78和CHOP蛋白亦隨毒胡蘿卜素作用時間延長呈線性遞增,結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析提示,毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞通透性改變相關(guān)。
　　(2)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維改變:毒胡蘿卜素作用1h后,通過鬼筆環(huán)肽染色,各組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞可見F-actin主要分布在細(xì)胞膜的周邊,向外突出呈毛刺狀,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見密集的應(yīng)力纖維,隨著作用時

13、間的延長,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化,應(yīng)力纖維形成增多,向周邊的毛刺狀突起更明顯,對照組F-actin表達(dá)不明顯,細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則。
　　(3)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化和IP3R受體蛋白的表達(dá):毒胡蘿卜素作用內(nèi)皮細(xì)胞1h后,IP3受體蛋白的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度均升高,隨著作用時間的延長,IP3R-I蛋白表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度均持續(xù)上升,呈遞增趨勢,組間比較顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05,p<0.05),結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子及肺血管內(nèi)皮

14、細(xì)胞通透性相關(guān)性分析,提示IP3受體鈣離子通路途徑可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致血管通透性改變的調(diào)節(jié)。
　　(4)?；撬岣深A(yù)作用:在細(xì)胞培養(yǎng)基中注入200ml/L?；撬?在注入毒胡蘿卜素作用肺血管內(nèi)皮細(xì)胞后,與單純毒胡蘿卜素作用6h組進(jìn)行比較,各項指標(biāo)出現(xiàn)明顯的下降趨勢。牛磺酸和毒胡蘿卜素共同作用6h后與單純毒胡蘿卜素誘導(dǎo)組6h進(jìn)行比較,?；撬岣深A(yù)后,血管通透性較單純毒胡蘿卜素6h組降低,GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)較單純毒胡蘿卜素作用