內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧小鼠血管內(nèi)皮功能障礙中的作用.pdf

1、背景：
　　阻塞性睡眠呼吸綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，是在睡眠過程中反復(fù)發(fā)生的阻塞性低通氣或呼吸暫停。間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）被認(rèn)為是 OSAS的主要特征和重要損傷機(jī)制，是引發(fā)一系列心血管疾病的關(guān)鍵因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在許多病理生理刺激下（如氧化應(yīng)激、缺血、缺氧）都可以發(fā)生，尤其是參與 OSAS相關(guān)的疾病如動脈粥

2、樣硬化、糖尿病、缺血性心肌病等的發(fā)生。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與 OSAS患者的血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)。除了細(xì)胞死亡受體和線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被發(fā)現(xiàn)是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的另一種途徑。因此，我們推測間歇性低氧可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷引起血管功能紊亂。
　　目的：
　　1.建立 IH小鼠模型，應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑，觀察 IH對小鼠血壓和血管舒張功能的影響及IH小鼠胸主動脈中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的相對表達(dá)；

3、　　2.建立血管內(nèi)皮細(xì)胞 IH模型，觀察不同程度的間歇性低氧對細(xì)胞損傷的影響，并且研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在不同程度間歇性低氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為防治間歇性低氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙提供依據(jù)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)將雄性健康昆明小鼠分為正常對照（Control）組、間歇性低氧（IH）組和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA）干預(yù)（IH+4-PBA）組，采用套尾法無創(chuàng)測量小鼠尾動脈收縮壓（SBP），用血管張力測定技術(shù)（my

4、ography）檢測小鼠胸主動脈的功能，采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Bolt）的方法檢測胸主動脈中GRP78和 CHOP蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）分為正常培養(yǎng)（IH0 h）組、IH6 h組、IH12 h組和IH24 h組，并且對每組應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA，用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞的活力，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA

5、）法測定內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的含量。
　　1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧誘發(fā)小鼠血壓升高中的作用
　　將雄性健康昆明小鼠分為正常對照（Control）組、間歇性低氧（IH）組和間歇性低氧4-PBA干預(yù)（IH+4-PBA）組，IH組和 IH+4-PBA組放入低氧倉進(jìn)行間歇性低氧處理，每天8 h，連續(xù)28 d，間歇性低氧處理最后一周給予小鼠腹腔注射4-PBA（100mg/kg/d），Control組不放入低氧倉，其余條件和

6、處理組相同。28天后采用套尾法無創(chuàng)測量小鼠尾動脈收縮壓（SBP）。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧引起的小鼠血管內(nèi)皮功能障礙中的作用
　　采用離體血管張力測定的方法檢測三組小鼠胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張和內(nèi)皮非依賴性舒張變化情況，觀察小鼠動脈的舒縮功能變化。
　　3.間歇性低氧對小鼠胸主動脈中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　采用 Western Bolt法檢測三組小鼠胸主動脈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78和CHOP

7、蛋白的表達(dá)水平。
　　4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力影響中的作用
　　將HUVECs正常培養(yǎng)12 h后，換成無血清培養(yǎng)液。設(shè)IH0 h組、IH6 h組、IH12 h組和 IH24 h組，并且對每組應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA（2 mmol/L），用Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞的活力，觀察間歇性低氧及應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA對細(xì)胞活力的影響。
　　5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇

8、性低氧對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響中的作用
　　將HUVECs分為IH0 h組、IH6 h組、IH12 h組和IH24 h組，并且對每組應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑4-PBA，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡變化情況。
　　6.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間歇性低氧對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS含量影響中的作用
　　用 ELISA法測量各組細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的含量，觀察間歇性低氧和4-PBA對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的eNOS含量的影響。
　　

9、結(jié)果：
　　1.間歇性低氧可以導(dǎo)致小鼠血壓升高，其作用可被4-PBA抑制。
　　2.間歇性低氧可以導(dǎo)致小鼠胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張減弱，4-PBA可改善 IH小鼠的胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能；內(nèi)皮非依賴性舒張無差異。
　　3.間歇性低氧導(dǎo)致小鼠胸主動脈 GRP78表達(dá)下降，4-PBA導(dǎo)致其表達(dá)增加，CHOP蛋白表達(dá)增加，4-PBA導(dǎo)致其表達(dá)下降。
　　4.間歇性低氧可以使HUVECs活力下降，其作用可被4-PBA抑