多肽作為識(shí)別元件及在其免疫分析伏馬菌素B1中的應(yīng)用.pdf

1、伏馬菌素B1(Fumonisin B1,FB1)主要是由串珠鐮刀菌、層生鐮刀菌等鐮刀菌屬產(chǎn)生的水溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物,主要污染玉米,小麥及其他谷物,也是伏馬菌素(Fumonisins)家族中毒性最強(qiáng)的,能夠?qū)е埋R腦白質(zhì)軟化癥,豬肺水腫,人的原發(fā)性肝癌,食道癌等。真菌毒素檢測(cè)是保障食品安全的重要環(huán)節(jié),為了精確定量真菌毒素,各種檢測(cè)方法已經(jīng)建立,如氣相色譜法,高效液相色譜法,酶聯(lián)免疫分析等。其中免疫學(xué)檢測(cè)是基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫分析技術(shù),

2、具有簡(jiǎn)便快速、廉價(jià)和便于高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)。包括真菌毒素在內(nèi)的小分子因其分子量,表位單一,不能同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗體,因此免疫檢測(cè)小分子主要是競(jìng)爭(zhēng)模式,其需要將小分子與載體蛋白(BSA,OVA等)偶聯(lián)制備檢測(cè)抗原或者與標(biāo)記分子偶聯(lián)制備競(jìng)爭(zhēng)抗原。這個(gè)過程需要專業(yè)的操作人員,及復(fù)雜的分離純化過程,特別是有機(jī)溶劑的引入易造成對(duì)操作人員傷害和環(huán)境污染。
　　本實(shí)驗(yàn)以 FB1為研究對(duì)象,采用噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù),以 FB1單克隆抗體3F11為靶分子,

3、應(yīng)用生物淘選及分子克隆技術(shù),生物合成了異源性 FB1檢測(cè)抗原。基于生物合成的 FB1檢測(cè)抗原,建立了玉米中 FB1的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。其次,分別以抗 FB1單克隆抗體和多克隆抗體與 FB1形成的復(fù)合物為靶分子,采用負(fù)篩選的方法,淘選噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù),為篩選抗小分子抗原抗體復(fù)合物多肽,建立非競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)小分子提供參考,主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用噬菌體淘選技術(shù),獲得了7種能特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3F11的模擬表位,分別命名為 F1,F

4、3,F4,F7,F15,F17,F22。采用間接競(jìng)爭(zhēng) Phage-ELISA,建立了基于 F1,F3,F4,F7,F15,F17,F22的標(biāo)準(zhǔn)曲線,IC50分別為0.422±0.021 ng/mL,0.534±0.024 ng/mL,0.464±0.031 ng/mL,0.351±0.023 ng/mL,0.875±0.059 ng/mL,0.405±0.022 ng/mL,0.312±0.025 ng/mL。以F1為研究對(duì)象,建立了基

5、于噬菌體展示 FB1模擬表位 PVDF膜基質(zhì)法檢測(cè)FB1,檢測(cè)閾值為2.5 ng/mL,可裸眼直接判斷結(jié)果。
　　2.采用PCR技術(shù),克隆了7種FB1模擬表位,成功構(gòu)建了pMAL-F1-MBP, pMAL-F3-MBP, pMAL-F4-MBP, pMAL-F7-MBP, pMAL-F15-MBP, pMAL-F17-MBP,pMAL-F22-MBP7個(gè)原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至TB1中,經(jīng)0.3mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得了生物合成F

6、B1檢測(cè)抗原:F1-MBP,F3-MBP,F4-MBP, F7-MBP,F15-MBP,F17-MBP,F22-MBP。經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析,結(jié)果顯示只有 F1-MBP, F15-MBP能與 FB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合3F11, IC50分別為2.15±0.13ng/mL,1.26±0.08 ng/mL。
　　3.以生物合成的 FB1檢測(cè)抗原 F1-MBP為研究對(duì)象,對(duì)比分析了 pH,鹽離子強(qiáng)度,甲醇濃度以及熱處理對(duì) F1-MBP和人工抗

7、原 FB1-BSA免疫學(xué)性能影響,結(jié)果顯示兩者免疫學(xué)性能基本無(wú)差異。建立了基于 F1-MBP的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線和 IC50為2.15±0.13 ng/mL,與 FB1-BSA(IC50為21.39±1.15)相比,靈敏度提高了約10倍。同時(shí)建立了基于 F1-MBP膜基質(zhì)檢測(cè) FB1,檢測(cè)閾值為2.5 ng/mL,與 FB1-BSA相比靈敏度提高了10倍。分別用以上兩種方法和傳統(tǒng)的商業(yè)化ELISA試劑盒檢測(cè)30份玉米樣品,結(jié)果顯