飼料中伏馬菌素B1電化學生物傳感器檢測方法建立與應用.pdf

1、霉菌毒素(Mycotoxins)是由各種霉菌產(chǎn)生的一系列有毒次級代謝產(chǎn)物。在不同的霉菌毒素中，伏馬菌素是世界上玉米種植區(qū)最常見的霉菌毒素，由于其與人類和家畜疾病有關，因此玉米谷物中伏馬菌素污染被認為是一個嚴峻的問題。伏馬菌素包括伏馬菌素B1、B2和B3，是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的，主要自然產(chǎn)生于串珠鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和多育鐮刀菌。伏馬菌素可導致馬的腦白質(zhì)軟化癥，這是在馬中發(fā)生的一種嚴重甚至死亡的疾病，也可引起豬的致命疾病-豬的肺水腫綜合癥。伏

2、馬菌素已被國際癌癥研究機構(IARC)列為人類可能的致癌物。
　　近年來，霉菌毒素的檢測技術不斷發(fā)展，常見的檢測技術有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。其中高效液相色譜具有較高的靈敏度和可靠性，是當前使用最多的方法。但HPLC需要對樣品進行提取凈化，操作較為復雜，且檢測周期較長。
　　電化學生物傳感器將生物分析方法與電化學傳感器技術結合，

3、既具有高選擇性又兼有高靈敏性，在生物工程、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥工業(yè)、食品安全和農(nóng)業(yè)分析等領域有廣闊的應用前景。納米材料具有諸多優(yōu)良特點，如比表面積大、催化活性高、親和力強、具有優(yōu)秀的生物相容性等，已廣泛應用于電化學生物傳感器的制備。近年來，具有微型化、特異性強、靈敏度高的電化學生物傳感器技術成為霉菌毒素檢測的發(fā)展趨勢。
　　本試驗將飼料中的伏馬菌素B1(FB1)作為研究對象，通過完全抗原的制備，以單克隆抗體技術為支撐，分別采用間接競爭和

4、直接競爭的檢測原理，以硫堇作為信號探針，對構建伏馬菌素B1的電化學生物傳感器進行了探索。
　　試驗Ⅰ基于納米磁珠和石墨烯信號放大的電化學免疫傳感器的構建
　　為了制備FB1的單克隆抗體并測定其效價，本試驗采用戊二醛法將FB1與卵清蛋白(OVA)載體蛋白偶聯(lián)，制備FB1完全抗原FB1-OVA。偶聯(lián)后的FB1-OVA通過考馬斯亮藍試劑盒檢測蛋白質(zhì)含量為1 mg/mL。通過SDS-PAGE鑒定FB1-OVA偶聯(lián)成功，將其作為ELI

5、SA檢測抗體效價的包被抗原。采用腹水制備技術制備腹水型FB1單克隆抗體。首先，復蘇培養(yǎng)雜交瘤細胞，觀察細胞形態(tài)，測定細胞上清抗體效價及其穩(wěn)定性。復蘇的雜交瘤細胞形態(tài)良好，其上清抗體效價為1∶1600，分泌抗體穩(wěn)定性良好。其次，選取20只BALB/c雌性小鼠，腹腔注射雜交瘤細胞懸液。試驗期間，每天觀察小鼠生長情況，待小鼠腹部膨大時，收集腹水。利用HiTrap Protein G HP蛋白純化柱純化腹水獲得FB1的單克隆抗體，通過蛋白質(zhì)含量

6、測定，F(xiàn)B1單克隆抗體的濃度為10 mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，F(xiàn)B1單克隆抗體分子量為149.50 kDa，且抗體純度較高。通過ELISA測定，F(xiàn)B1腹水單克隆抗體的效價為1∶102400，可用于構建電化學免疫傳感器。
　　采用硫堇作為電活性探針，構建了一種新的以Fe3O4磁珠作為信號分子載體的電化學免疫傳感器用于檢測FB1。首先，利用硫堇與石墨烯制備石墨烯硫堇復合物，通過紫外分光光度計表征石墨烯硫堇復合物合成成功。然后

7、，將連有氨基的Fe3O4磁珠與羊抗鼠二抗通過戊二醛偶聯(lián)，獲得Fe3O4磁珠/Ab2偶聯(lián)物。用EDC和NHS激活石墨烯硫堇復合物的羧基，與Fe3O4磁珠/Ab2偶聯(lián)物氨基連接，成為該電化學免疫傳感器的信號分子。本試驗中采用金電極作為工作電極，將金電極浸入半胱氨酸進行自組裝，通過戊二醛作為連接臂，修飾FB1-BSA偶聯(lián)物，用3％BSA溶液封閉非特異性結合位點。樣品溶液中的FB1與電極表面固定的FB1-BSA偶聯(lián)物競爭結合Ab1，信號分子與A

8、b1連接。通過循環(huán)伏安法檢測電極表面硫堇的電流響應值對FB1進行定量。本試驗中，通過交流阻抗法對電極修飾過程進行電化學表征，結果顯示電極表面進行了層層組裝，對電子傳遞的阻礙逐漸增加。優(yōu)化了電化學免疫傳感器的檢測條件，結果發(fā)現(xiàn)FB1-BSA包被抗原的最佳濃度為100μg/mL，Ab1的最佳稀釋比例為1∶7000，Ab2的最佳稀釋比例為1∶10000，循環(huán)伏安法檢測溶液最佳pH為7.0，F(xiàn)B1與FB1-BSA競爭結合Ab1的最佳孵育時間為4

9、0 min，反應溫度為37℃。在最佳試驗條件下，該免疫傳感器的線性范圍從10-8 mg/mL到10-4 mg/mL，線性方程為I（μA）=55.7-66.2×lgCFB1(mg/mL)，相關系數(shù)為-0.9989，檢測限為0.01 ng/mL。結果表明該傳感器具有良好的重復性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性。
　　試驗Ⅱ基于金納米顆粒和石墨烯硫堇復合物雙重信號放大電化學適配體傳感器的構建
　　本試驗中，構建了一種基于金納米顆粒和石墨烯

10、硫堇復合物(GS-TH)雙重信號放大的電化學適配體傳感器用于檢測FB1。首先，通過改進的氯金酸還原法制備了金納米顆粒，通過透射電子顯微鏡表征，制備的金納米顆粒直徑為13nm。本試驗中采用的工作電極為玻碳電極，將金納米顆粒滴至電極表面干燥后，修飾捕獲DNA，捕獲DNA與適配體DNA特異性結合，將修飾電極浸入石墨烯硫堇溶液中自組裝。通過循環(huán)伏安法檢測探針硫堇的電化學信號。樣品溶液中的FB1與適配體DNA發(fā)生特異性結合，使得石墨烯硫堇復合物從

11、電極表面脫落，電化學信號降低。通過循環(huán)伏安法檢測電極表面硫堇的減少量對FB1進行定量。優(yōu)化了電化學適配體傳感器的檢測條件，捕獲DNA的最佳反應濃度為0.25μM，石墨烯硫堇復合物固定的最佳時間為3h。在優(yōu)化條件下，建立該電化學適配體傳感器用于檢測FB1的標準曲線，其中FB1濃度的線性范圍為10-12至10-4 mg/mL，線性方程為△I(μA)=1.175+0.067×lgCFB1(mg/mL)，相關系數(shù)為0.9982，F(xiàn)B1的檢測限為

12、1 pg/mL。結果表明該傳感器具有良好的重復性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和特異性。
　　試驗Ⅲ電化學適配體傳感器與高效液相色譜法的比較
　　在試驗Ⅱ中已建立的電化學適配體傳感器標準曲線，通過樣品的加標檢測，F(xiàn)B1的最低檢測限為1μg/kg。測定玉米、小麥和全價飼料樣品中FB1的回收率，添加FB1濃度分別為5μg/kg、50μg/kg和100μg/kg，結果顯示，三種飼料的回收率均高于90.0％，變異系數(shù)均小于10.0％。
　　

13、本試驗建立FB1高效液相色譜法的標準曲線，F(xiàn)B1的檢測范圍為10～1000 ng/mL，線性相關系數(shù)r為0.9998。通過樣品的加標檢測，F(xiàn)B1的最低檢測限為10μg/kg。測定玉米、小麥和全價飼料樣品中FB1的回收率，添加FB1濃度分別為50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg，三種飼料的回收率均高于80.0％，變異系數(shù)均小于10.0％。
　　收集來自全國各地飼料送檢樣品62份，主要包括玉米、小麥、全價飼料等其他飼料。

14、經(jīng)過提取、凈化后，分別采用電化學適配體傳感器和HPLC檢測樣品中FB1的含量。結果顯示，62份飼料樣品，兩種檢測方法的檢出率均為100％。采用電化學適配體傳感器檢測全部飼料樣品中FB1平均含量為833.3μg/kg，高于HPLC檢測值791.4μg/kg。比較適配體傳感器和HPLC兩種檢測方法的相關性，將檢出FB1飼料的HPLC檢測結果作為橫坐標，同一樣品的適配體傳感器結果作為縱坐標，建立相關曲線，相關系數(shù)為0.9999，結果表明，適配