BAFF拮抗肽活性的研究.pdf

1、BAFF為B淋巴細(xì)胞刺激因子,屬于腫瘤壞死因子超家族中的一員,在B淋巴細(xì)胞的發(fā)展,成熟,抗體分泌過程中起重要的作用,是正常機(jī)體免疫必不可少的。研究發(fā)現(xiàn)BAFF表達(dá)失調(diào)與許多疾病之間存在一定的聯(lián)系,如自身免疫缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、感染和惡性腫瘤等等。目前,針對(duì)BAFF的拮抗劑主要有:抗BAFF抗體,BAFF受體抑制劑、BAFF相關(guān)免疫毒素等等。其中BAFF單克隆抗體-Belimumab已獲得美國FDA的批準(zhǔn),應(yīng)用于治療SLE疾病

2、,這充分肯定了以BAFF為靶點(diǎn)治療疾病的可行性。但是,在BAFF拮抗劑的臨床應(yīng)用中,仍有很多問題有待解決,例如,穩(wěn)定性和副作用。本課題的主要目的是研究三個(gè)多肽對(duì)BAFF與其受體結(jié)合的抑制作用,進(jìn)而探索小分子多肽作為BAFF拮抗劑的可行性,為BAFF拮抗肽的研發(fā)和臨床試驗(yàn)提供參考。這三個(gè)多肽分別為TA、TC和BC,均為通過InsightII軟件,根據(jù)TACI-BAFF、BCMA-BAFF的相互作用所涉及到的關(guān)鍵的氨基酸殘基,結(jié)合分子對(duì)接法

3、,而設(shè)計(jì)得到。
　　本課題主要的研究方法為,采用菌液PCR、重組質(zhì)粒雙酶切法和基因測序驗(yàn)證重組子TACI-Fc和BCMA-Fc的正確性。之后轉(zhuǎn)入原核表達(dá)宿主細(xì)胞中,進(jìn)行大量表達(dá),最后通過蛋白A柱進(jìn)行純化融合蛋白。通過間接ELISA試驗(yàn)考察所得融合蛋白與BAFF的結(jié)合活性,最后通過競爭ELISA試驗(yàn)研究多肽對(duì)BAFF-TACI和BAFF-BCMA結(jié)合的抑制作用。具體研究成果如下:
　　(1)驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室保存的pET28a-TA

4、CI-Fc和pET30a-BCMA-Fc重組子的正確性,并且成功進(jìn)行了這兩個(gè)融合蛋白的原核系統(tǒng)可溶性表達(dá)。
　　(2)通過間接ELISA試驗(yàn)考察了所得融合蛋白與BAFF的結(jié)合活性,并且確定了BAFF-TACI-Fc和BAFF-BCMA-Fc結(jié)合的最佳飽和濃度,分別為5ng/μL和30ng/μL。
　　(3)競爭ELISA試驗(yàn)證明三個(gè)多肽TA、TC和BC都對(duì)BAFF-TACI和BAFF-BCMA結(jié)合有一定的抑制作用,并且不同多