應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)研究干擾素-α2b的模擬肽和拮抗肽.pdf

1、干擾素(interferon，IFN)是一類重要的細(xì)胞因子，作為抗病毒和抗腫瘤的藥物已廣泛用于臨床。IFN通過(guò)與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活信號(hào)通路，誘導(dǎo)相關(guān)抗病毒、抗腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，發(fā)揮其生物學(xué)作用。而蛋白質(zhì)之間的相互作用或識(shí)別是通過(guò)局部肽段間的少量氨基酸殘基相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，合理設(shè)計(jì)的小肽可以完全或部分模擬完整蛋白分子的功能。通常完整的蛋白分子由于對(duì)蛋白酶敏感、具有宿主免疫原性以及成本高等原因并不是最佳的候選藥物。IFN除了具

2、有以上不足外，在臨床使用時(shí)還會(huì)出現(xiàn)副作用，限制了其使用。而小分子肽類細(xì)胞因子模擬物或拮抗劑由于其相對(duì)分子質(zhì)量小、易于合成、無(wú)抗原性和毒副作用較小等特點(diǎn)，在基礎(chǔ)研究以及臨床治療等領(lǐng)域逐漸顯現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)。本論文以IFN-α2b為研究對(duì)象，以Anti-IFN-α2b多克隆抗體、天然表達(dá)IFN受體的細(xì)胞為靶標(biāo)，利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)，研究IFN-α2b的抗原表位、篩選IFN-α2b的拮抗肽和模擬肽，對(duì)研究IFN的分子機(jī)制以及設(shè)計(jì)和開發(fā)IFN小分子

3、模擬肽藥物有重要的意義。 本文首先以結(jié)合有Anti-IFN-α2b多克隆抗體的免疫磁性微球?yàn)榘袠?biāo)，篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)。經(jīng)ELISA鑒定，四輪篩選后同抗體結(jié)合的噬菌體得到明顯的富集，其陽(yáng)性率達(dá)到53％(49/92)。隨機(jī)挑取12個(gè)陽(yáng)性噬菌體進(jìn)行序列分析并與IFN-α2b序列進(jìn)行同源比對(duì)。結(jié)果顯示：12個(gè)陽(yáng)性克隆可分為三組，分別對(duì)應(yīng)IFN-α2bN端(1～13)、AB環(huán)附近(35～47)和CD環(huán)附近(98～110)的三組高抗原性

4、表位區(qū)，與IFN抗原預(yù)測(cè)分析的數(shù)據(jù)相吻合。特異性抗體封閉試驗(yàn)和噬菌體免疫試驗(yàn)表明，所得到的噬菌體展示肽在免疫反應(yīng)性和免疫原性上均可以一定程度地模擬IFN-α2b不同的表位區(qū)。結(jié)合IFN的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，三組模擬表位均暴露在IFN分子結(jié)構(gòu)的外部，更容易被抗原呈遞細(xì)胞上的抗原識(shí)別受體所識(shí)別。其中第二組表位AB環(huán)(29～35)直接參與與IFN受體的結(jié)合，推測(cè)在使用IFN治療疾病過(guò)程中，針對(duì)該區(qū)域所產(chǎn)生的中和抗體可能直接影響IFN的生物學(xué)活性

5、。 采用基因重組技術(shù)，本文成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)/GFP-IFN-α2b，并在大腸桿菌E.coliBL21中成功地進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE和Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示該融合蛋白GFP-IFN-α2b保持了良好的IFN抗原性；受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，該融合蛋白能夠與WISH細(xì)胞上的IFN受體結(jié)合，并在488nm激發(fā)光下呈現(xiàn)亮綠色熒光；抗病毒實(shí)驗(yàn)表明，該融合蛋白具有一定的抗病毒活性，比活力為1.0×107IU/m

6、g，證明該融合蛋白為具有綠色熒光和IFN抗病毒活性的雙功能蛋白。本研究為在細(xì)胞及分子水平研究IFN與靶細(xì)胞相互作用提供了簡(jiǎn)便、快捷、直觀的研究材料，同時(shí)也為IFN的代謝及功能研究建立了方法學(xué)基礎(chǔ)。 以天然表達(dá)IFN受體的WISH細(xì)胞并結(jié)合Anti-IFN-α2b多克隆抗體為靶分子，本文采用競(jìng)爭(zhēng)性洗脫的方法篩選噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)。經(jīng)鑒定六輪篩選后同細(xì)胞和抗體結(jié)合的噬菌體得到明顯的富集，最后一輪篩選的陽(yáng)性率達(dá)到51.1％(23/45)

7、。隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析并與IFN序列進(jìn)行同源比對(duì)。結(jié)果顯示：10個(gè)克隆可分為三組，分別對(duì)應(yīng)IFNAB環(huán)的24～41和43～49以及E螺旋的148～158位氨基酸殘基。分別選取對(duì)應(yīng)AB環(huán)的第一組的No.26，以及E螺旋第三組的No.35兩個(gè)噬菌體克隆為例做進(jìn)一步研究。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，No.26和No.35能與IFN競(jìng)爭(zhēng)性的同IFN受體或抗體結(jié)合。以其展示的序列分別合成SP-7(SLSPGLP)和FY-

8、7(FSAPVRY)兩個(gè)小肽。細(xì)胞受體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示，SP-7和FY-7能夠有效地模擬IFN的部分受體結(jié)合表位，特異性地抑制IFN與其受體的結(jié)合，其IC50值分別為8.90μg和3.22μg。采用細(xì)胞病變抑制法分析SP-7和FY-7對(duì)IFN抗病毒活性的影響，結(jié)果顯示當(dāng)兩個(gè)合成肽的加入量在6.25～100μg之間時(shí)，合成肽對(duì)IFN抗病毒活性均具有抑制作用，并且存在劑量依賴關(guān)系，其IC50約為25μg，證明SP-7和FY-7為兩個(gè)IFN拮抗肽

9、。 為了得到具有抗病毒活性的IFN模擬肽，本文在上述細(xì)胞篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)上述同細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，又增加了三輪功能篩選。經(jīng)鑒定具有抗病毒活性的噬菌體克隆得到了一定的富集，其陽(yáng)性率為1.98％(20/1012)。隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析并與IFN-α2b的序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示：10個(gè)克隆可分為四組，分別對(duì)應(yīng)IFN的31～37、68～74、93～121和132～161位氨基酸殘基。其中第一組的No.T9(31～37)與IF

10、N中AB環(huán)(26～35)有部分重疊；第四組中的No.T3(143～149)與IFN中E螺旋(141～158)有部分重疊，并且其序列中144R和149R與IFN分子中參與受體結(jié)合并激活信號(hào)通路的“熱點(diǎn)”氨基酸一致。競(jìng)爭(zhēng)ELISA和細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，No.T9和No.T3能與IFN競(jìng)爭(zhēng)性的同IFN受體結(jié)合。以其展示的序列分別合成KP-7(NVHPP)和IR-7(IRPDTPR)兩個(gè)小肽。細(xì)胞受體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示，KP-7和IR-7能有效地模

11、擬IFN的部分受體結(jié)合表位，特異性地抑制IFN與其受體的結(jié)合，其IC50值分別為13.43μg和9.49μg。細(xì)胞病變抑制法的抗病毒實(shí)驗(yàn)表明：KP-7和IR-7在1.25～5μg范圍內(nèi)，表現(xiàn)出一定的抗病毒活性，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，證明KP-7和IR-7為兩個(gè)模擬IFN不同表位具有抗病毒作用的模擬肽。其中KP-7抗病毒活性略高于IR-7，并在發(fā)揮抗病毒作用時(shí)兩者呈現(xiàn)出一定的協(xié)同作用，提示IFN的抗病毒作用是多位點(diǎn)共同作用其受體的結(jié)果。