靈芝活性肽的保肝活性研究及其結(jié)構(gòu)初探.pdf

1、目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于靈芝多糖及靈芝三萜類化合物的提取純化與藥理作用研究比較透徹，然而對(duì)靈芝肽(GLP)的研究卻鮮有涉及；本室前期工作已對(duì)靈芝活性肽進(jìn)行了初步分離，并證實(shí)其具有很好的抗氧化活性及對(duì)CCl4致肝損傷有很好的輔助保護(hù)作用。為了深入研究靈芝肽的保肝活性及其構(gòu)效關(guān)系，本文對(duì)靈芝原料進(jìn)行了選擇，考察了8種樹(shù)脂對(duì)靈芝肽的脫鹽效果；通過(guò)體外試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究了靈芝肽與靈芝多糖、靈芝三萜類化合物的協(xié)同抗氧化、保肝作用；分別采用了D-氨基半乳糖

2、(D-GalN)、乙醇及卡介苗/脂多糖(BCG+LPS)三種急性肝損傷小鼠模型，進(jìn)一步研究了靈芝肽的保肝作用；采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析法，考察了靈芝肽分子量分布；借助于RP-HPLC、HPLC-MS/MS等手段解析了一種靈芝肽結(jié)構(gòu)，初步探討了靈芝肽的結(jié)構(gòu)與其活性的關(guān)系。
　　 1.靈芝原料的選擇、靈芝肽的提取與脫鹽。
　　 (1)比較了靈芝子實(shí)體粉、兩種靈芝菌絲體粉、赤芝子實(shí)體菌蓋及菌柄水提液的粗蛋白

3、含量和抑制羥基自由基活性，結(jié)果顯示：靈芝子實(shí)體粉與靈芝菌絲體粉1的粗蛋白質(zhì)含量及對(duì)羥基自由基的抑制率基本相當(dāng)，其粗蛋白質(zhì)含量雖不及靈芝菌絲體粉2，但與靈芝菌絲體粉2比較，其對(duì)羥基自由基的抑制率的差異相對(duì)較??；由于靈芝菌絲體粉1已商品化，經(jīng)綜合考慮，選擇了靈芝菌絲體粉1作為本實(shí)驗(yàn)的原料。
　　 (2)靈芝水提液超濾后經(jīng)Cu2+-Sephadex G-25配位色譜法分離后得到兩個(gè)肽峰，是兩組復(fù)合肽。
　　 (3)比較S-8、

4、XAD-16、DA201-C、NAK-Ⅱ、D4020、AB-8六種大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率、脫鹽率及靜態(tài)解吸附效果，結(jié)果顯示：S-8樹(shù)脂對(duì)靈芝肽的吸附率及在70％乙醇中的解吸附率均最大，但是DA201-C樹(shù)脂的脫鹽率最高，且其吸附與解吸附效果也接近于S-8樹(shù)脂，因此選擇DA201-C樹(shù)脂進(jìn)行了動(dòng)態(tài)吸附的正交試驗(yàn)，確定了最佳的吸附條件為：上樣流速為1.6 mL/min、pH值為5.5、上樣濃度為2.0mg/mL；比較經(jīng)大孔樹(shù)脂(S-8樹(shù)脂和D

5、A201-C樹(shù)脂)和陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理的兩種脫鹽方法，結(jié)果顯示：大孔樹(shù)脂的脫鹽效果優(yōu)于陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；而大孔樹(shù)脂DA201-C與S-8相比較，雖然后者的氮回收率稍高，但其·OH抑制活性和脫鹽率均不如前者。經(jīng)綜合考慮，宜選用大孔樹(shù)脂DA201-C作為靈芝肽脫鹽的柱材料。
　　 2.靈芝肽對(duì)三種肝損傷模型的保肝作用。
　　 (1)與D-GalN肝損傷模型組小鼠比較，當(dāng)灌胃中(120mg/kg·bw)、高劑量(180m

6、g/kg·bw)GLP時(shí)，能顯著(p<0.05)或極顯著(p<0.01)地降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，同時(shí)也能顯著地抑制肝勻漿中谷胱甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力的下降及丙二醛(MDA)含量的升高(p<0.01)；生化指標(biāo)測(cè)定及病理學(xué)觀察均顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量給肽組小鼠肝細(xì)胞病變明顯好轉(zhuǎn)或恢復(fù)。
　　 (2)急性酒精性肝損傷模型的生化指標(biāo)變化明顯，而肝組織病理學(xué)變

7、化不明顯。模型組的ALT、AST、TG、GSH、MDA、SOD等指標(biāo)與對(duì)照組相比，均發(fā)生了顯著變化，說(shuō)明造模是成功的。與乙醇肝損傷模型組小鼠比較，當(dāng)灌胃低(60mg/kg·bw)、中(120mg/kg·bw)、高劑量(180mg/kg·bw)GLP時(shí)，均能極顯著地降低血清AST/ALT的活性和TG的含量(p<0.01)，可極顯著地拮抗小鼠肝勻漿中GSH含量與SOD活力的下降與MDA的產(chǎn)生(p<0.01)，并極顯著地抑制肝、脾指數(shù)的增大(

8、p<0.01)；肝組織病理學(xué)觀察顯示：高劑量給肽組小鼠肝細(xì)胞與正常組小鼠肝細(xì)胞基本相同。中劑量組的效果與陽(yáng)性對(duì)照藥物硫普羅寧組(50mg/kg·bw)相當(dāng)，其中尤以高劑量靈芝肽的保肝作用明顯。
　　 (3)與BCG+LPS致肝損傷模型組小鼠比較，當(dāng)灌胃中(120mg/kg·bw)、高劑量(180 mg/kg·bw)GLP時(shí)，能顯著(p<0.05)或極顯著(p<0.01)降低小鼠血清中ALT、AST活性以及肝、脾指數(shù)，同時(shí)也能顯著

9、地抑制肝勻漿中GSH含量、GSH-Px/SOD活力的下降(p<0.01)及MDA與NO含量的升高；生化指標(biāo)測(cè)定及病理學(xué)觀察均顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量組的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均趨近于正常組，某些生化指標(biāo)甚至好于正常組。
　　 總之，靈芝肽灌胃劑量為180 mg/kg·bw時(shí)，對(duì)D-氨基半乳糖(D-GalN)、乙醇及卡介苗加脂多糖(BCG+LPS)三種急性肝損傷小鼠模型均有很好的保護(hù)作用。
　　 3.靈芝肽、多糖、三萜類化

10、合物及其協(xié)同抗氧化、保肝作用研究。
　　 (1)當(dāng)濃度為7.5mg/mL，GLP與濃度為25mg/mL的靈芝多糖(GLPS)組合時(shí)，其抑制羥基自由基效果比優(yōu)于單組分的作用效果，但尚未達(dá)到協(xié)同增效效果。
　　 (2)當(dāng)GLP與GLPS組合時(shí)，無(wú)論有無(wú)自由基誘導(dǎo)劑，組合組抑制小鼠體外肝勻漿中MDA生成的效果均優(yōu)于單組分組；當(dāng)濃度為12.5mg/mL的GLPS與三種劑量的GLP組合時(shí)，均呈現(xiàn)出了協(xié)同增效效果。
　　 (

11、3)在D-GalN肝損傷模型實(shí)驗(yàn)中，GLP(150mg/kg·bw)、GLPS(800mg/kg·bw)、靈芝三萜類化合物(GLT)(100mg/kg·bw)及三者組合，均能極顯著降低小鼠血清中ALT、AST活性，同時(shí)也能極顯著地抑制肝勻漿中SOD/GSH-Px活性、GSH含量的下降及MDA含量的升高(p<0.01)；但生化指標(biāo)除GSH外，三者組合組均未顯示出明顯的協(xié)同增效作用；但三者組合組小鼠肝細(xì)胞病變明顯好轉(zhuǎn)或恢復(fù)，效果好于單組分組

12、。
　　 4.靈芝肽分子量分布及靈芝肽結(jié)構(gòu)初探。
　　 GLP經(jīng)葡聚糖凝膠G-15層析分離，出現(xiàn)2個(gè)吸收峰，峰1組分的分子量范圍在5398.8-1148.9Da之間；峰2組分的分子量范圍在1148.9-52.0Da之間，峰2主要洗脫物的分子量范圍為530.0-244.5Da；采用HPLC、MS、MS/MS對(duì)與HPLC圖中主峰Ⅰ對(duì)應(yīng)的，M/Z為365.1的質(zhì)譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，該化合物是氨基酸序列為Ser-Asp-Gly-S